較之前的抗疲勞保健品評(píng)價(jià)方法中直接選用正常小鼠進(jìn)行給藥檢測(cè)，該實(shí)驗(yàn)增加束縛應(yīng)激進(jìn)行造模，模擬當(dāng)今社會(huì)由于長時(shí)間伏案工作、缺乏運(yùn)動(dòng)等情況所致的疲勞。ICR小鼠每天接受8h束縛，分別束縛5d、10d和15d，隨后進(jìn)行與疲勞相關(guān)的行為學(xué)檢測(cè)。在負(fù)重游泳檢測(cè)中除采用原唯一評(píng)價(jià)指標(biāo)“力竭時(shí)間”，增設(shè) “首次連續(xù)下沉?xí)r刻”作為早期出現(xiàn)指標(biāo)，印證負(fù)重游泳情況，相較更加敏感且動(dòng)物友好。根據(jù)臨床中疲勞人群主動(dòng)運(yùn)動(dòng)的意愿降低的現(xiàn)象，增加空?qǐng)鰧?shí)驗(yàn)，檢測(cè)CRS疲勞小鼠的自主活動(dòng)距離和時(shí)間。通過抓力測(cè)試評(píng)價(jià)其肌肉力量，反應(yīng)疲勞發(fā)生情況。

在CRS5d小鼠行為學(xué)檢測(cè)表現(xiàn)出一定體力疲勞趨勢(shì)，CRS10d小鼠負(fù)重游泳中力竭時(shí)間顯著縮短、首次連續(xù)下沉?xí)r刻提前并且抓力降低，均表現(xiàn)出疲勞現(xiàn)象，這可以反應(yīng)每天8h，持續(xù)10dCRS即可導(dǎo)致體力疲勞。相比CRS 10d小鼠，CRS 15d在負(fù)重游泳、空?qǐng)龊妥チz測(cè)中疲勞更為穩(wěn)定。通過生化指標(biāo)的檢測(cè)，從代謝產(chǎn)物堆積、能量物質(zhì)耗竭和氧化應(yīng)激三個(gè)方面對(duì)CRS造模后小鼠疲勞狀態(tài)進(jìn)行分析，其在15d時(shí)疲勞生化指標(biāo)更為穩(wěn)定。故得出束縛造成小鼠體力疲勞模型需要連續(xù)15d，每天束縛8h造模效果更為穩(wěn)定。

本研究用所建立的疲勞模型構(gòu)建方法（每天8h，連續(xù)束縛15d）在C57BL/6N和BALB/C兩種常用小鼠上進(jìn)行了驗(yàn)證，探究其疲勞建模方法的種屬適用性。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)C57BL/6N和BALB/C小鼠均表現(xiàn)出負(fù)重游泳力竭時(shí)間縮短和抓力降低等行為表現(xiàn)，表明連續(xù)15天，每天束縛8小時(shí)可以造成普遍的小鼠疲勞模型。

1.評(píng)價(jià)指標(biāo)體系

1）負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)：以“力竭時(shí)間”和“首次連續(xù)下沉?xí)r間”作為動(dòng)物體力的評(píng)價(jià)指標(biāo)。時(shí)間越短表明動(dòng)物的體力越差，反之亦然。

2）抓力實(shí)驗(yàn)：以“前肢抓力”作為動(dòng)物肌肉力量的評(píng)價(jià)指標(biāo)，抓力越大體力越強(qiáng)。

3）自主活動(dòng)：以“運(yùn)動(dòng)距離”、“運(yùn)動(dòng)總路程”、“運(yùn)動(dòng)時(shí)間”作為動(dòng)物體力評(píng)價(jià)指標(biāo)，數(shù)值越大表明體力越好。

4）生化指標(biāo)：

(1) 肝糖原：以“肝糖原”含量越高，表明其儲(chǔ)備能源越多，在運(yùn)動(dòng)中體力越好。

(2) 血乳酸：以運(yùn)動(dòng)后血清中“乳酸”含量越低，表示其代謝產(chǎn)物的堆積越少，越不易疲勞。

(3) 血糖：以運(yùn)動(dòng)后血清中“血糖含量越高，表明其可利用能源物質(zhì)剩余越多，體力越好。

(4) 乳酸脫氫酶：以運(yùn)動(dòng)后血清中“乳酸脫氫酶”活力越強(qiáng)，表明其細(xì)胞受到氧化應(yīng)激損傷越嚴(yán)重。

2. 國內(nèi)外現(xiàn)有模型的異同

截止目前為止，國內(nèi)外文獻(xiàn)中已報(bào)道的造成體力疲勞動(dòng)物模型的方法有：強(qiáng)迫運(yùn)動(dòng)、應(yīng)激、化學(xué)、免疫和炎癥、放射線、手術(shù)、基因工程和癌因等單一因素或多種因素誘導(dǎo)的方法構(gòu)建的一系列用于疲勞研究的動(dòng)物模型。而在這些方法中，強(qiáng)迫運(yùn)動(dòng)法是最為常用的造成體力疲勞的方法，如強(qiáng)迫游泳、轉(zhuǎn)輪攀爬、跑步等。除此之外，文獻(xiàn)中亦有采用束縛、睡眠干擾、或多種刺激因素相結(jié)合的（電擊、冰水刺激、噪聲刺激）應(yīng)激方法導(dǎo)致的動(dòng)物疲勞。如：Tanaka等對(duì)SD大鼠進(jìn)行睡眠干擾5天，就可導(dǎo)致其負(fù)重游泳力竭時(shí)間縮短等疲勞樣行為；Park等[9]將雄性C57BL/6J小鼠置于與其緊密接觸且無法活動(dòng)的圓柱形束縛器（長10 cm，直徑3 cm）中，每天束縛3 h，共15天可造成小鼠在空?qǐng)鲋凶灾骰顒?dòng)降低和強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間延長等疲勞癥狀。Zou等采用電擊、冰水游泳和束縛刺激多因素刺激23天造成SD大鼠轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)降低、自主活動(dòng)減少等疲勞現(xiàn)象[9]；Shao等采用束縛、強(qiáng)迫運(yùn)動(dòng)、擁擠環(huán)境飼養(yǎng)和嘈雜聲中暴露4種方法想結(jié)合成功誘導(dǎo)了SD大鼠的疲勞模型；Zhao等采用睡眠剝奪、強(qiáng)迫游泳、束縛和夾尾造成小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間縮短和空?qǐng)鲎灾骰顒?dòng)降低等疲勞癥狀。盡管這些誘導(dǎo)疲勞的方法能夠模擬當(dāng)今人們因繁重工作和生活壓力導(dǎo)致的體力疲勞，但因考慮因素多、操作復(fù)雜，不易控制，并且對(duì)造模過程沒有進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察和比較，不能判斷動(dòng)物出現(xiàn)疲勞現(xiàn)象的最佳時(shí)機(jī)。此外，對(duì)慢性束縛應(yīng)激所致的分子機(jī)制研究亦很有限。

3. 技術(shù)難點(diǎn)

（1）束縛器的選擇。本實(shí)驗(yàn)室采用自制束縛器，束縛器長度為6-8.5 cm（可根據(jù)動(dòng)物體積調(diào)節(jié)），內(nèi)徑為3 cm，周身有多個(gè)直徑為0.5 cm 的通氣孔。既保證了動(dòng)物的自主呼吸，又能保證動(dòng)物不會(huì)掙脫束縛器。為造模成功提供了基礎(chǔ)。

（2）造模時(shí)長的選擇。綜合了前期文獻(xiàn)調(diào)研和本實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，采用了每天束縛8h（10: 00～18: 00），分別束縛5d、10d和15d進(jìn)行比較。

（3）動(dòng)物的選擇。本實(shí)驗(yàn)采用了常用的ICR小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，為了驗(yàn)證不同品系小鼠對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，因此本實(shí)驗(yàn)又選擇了C57BL/6N和BALB/C兩種小鼠進(jìn)行了比較。

4. 創(chuàng)新性

（1）比較了每天束縛8h（10: 00-18: 00），分別束縛5d、10d和15d考察對(duì)ICR小鼠疲勞的影響。確立了采用連續(xù)15d、每天束縛8h 可以建立更穩(wěn)定、更有效的動(dòng)物疲勞模型。并且驗(yàn)證了該條件同樣也適用于C57BL/6N和BALB/C小鼠。

（2）揭示了該疲勞的發(fā)生與腓腸肌肌肉功能障礙有關(guān)。腓腸肌肌肉功能障礙可能涉及由AMPK信號(hào)通路介導(dǎo)的肌肉線粒體功能損傷以及自噬受阻的能量代謝失衡而產(chǎn)生。

5. 應(yīng)用價(jià)值

采用慢性束縛應(yīng)激的方法，將動(dòng)物限制在狹窄空間內(nèi)無法自由活動(dòng)而造成體力疲勞，能很好地模擬當(dāng)今人們因長期應(yīng)激所導(dǎo)致的“亞健康”狀態(tài)的體力疲勞狀態(tài)，如長期伏案或在有限空間內(nèi)工作、缺少運(yùn)動(dòng)、睡眠不足、以及工作和生活所帶來的生理和心理壓力等。因此，該模型為緩解體力疲勞保健的功效評(píng)價(jià)提供了一個(gè)已操作、穩(wěn)定可控的動(dòng)物模型。

動(dòng)物飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所的屏障環(huán)境，12 h 照明/12 h 黑暗( 照明: 8: 00-20:00) ，飼養(yǎng)期間給予動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)飼料和潔凈飲水。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵守國際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 不同CRS周期對(duì)ICR小鼠體重的影響

如圖1所示，與空白組相比在接受后，CRS小鼠在應(yīng)激下體重將發(fā)生一定程度的降低。經(jīng)過幾天的束縛，小鼠適應(yīng)應(yīng)激后體重開始穩(wěn)定增長，但仍然顯著低于空白組。最后不同束縛天數(shù)的小鼠體重趨于相近，但CRS 15d小鼠仍低于其余小鼠。

圖1 不同周期下CRS對(duì)ICR小鼠體重的影響。（n＝12，Mean ± SEM）。

3.2 不同CRS天數(shù)對(duì)ICR小鼠負(fù)重強(qiáng)迫游泳的影響

由圖2可見，在負(fù)重強(qiáng)迫游泳過程中，與空白組相比不同周期CRS下ICR小鼠均表現(xiàn)出一定程度的疲勞狀態(tài)，其力竭游泳時(shí)間均縮短。CRS5d小鼠力竭時(shí)間具有縮短趨勢(shì)，CRS10d和15d小鼠力竭時(shí)間顯著縮短（P<0.01，P<0.01）。與CRS10d相比CRS 15d小鼠疲勞程度進(jìn)一步加深。

圖2不同周期下CRS對(duì)ICR小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間的影響。（n＝12，Mean ± SEM），**P＜0.01。

因首次下沉?xí)r刻出現(xiàn)過早，且小鼠間游泳習(xí)慣可能存在較大差異，在作為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)易出現(xiàn)誤判。故我們提出首次連續(xù)下沉?xí)r刻這一指標(biāo)，首次連續(xù)下沉?xí)r刻為動(dòng)物從負(fù)重游泳開始直到連續(xù)在短時(shí)間內(nèi)下沉2次及以上的時(shí)刻。如圖3所示，CRS會(huì)引起小鼠負(fù)重游泳時(shí)的首次連續(xù)下沉?xí)r刻提前，5、10和15dCRS應(yīng)激均能顯著降低ICR小鼠的首次連續(xù)下沉?xí)r刻（P<0.01，P<0.01，P<0.001）。CRS5d小鼠的負(fù)重游泳首次連續(xù)下沉?xí)r刻已顯著提前，且該指標(biāo)比力竭時(shí)間可能更為敏感。

圖3不同周期下CRS對(duì)ICR小鼠負(fù)重游泳首次連續(xù)下沉?xí)r刻的影響。（n＝12，Mean ± SEM），**P＜0.01; ***P＜0.001。

3.3 不同CRS天數(shù)對(duì)ICR小鼠空?qǐng)鲎灾骰顒?dòng)的影響

臨床的觀察中發(fā)現(xiàn)，身體疲勞可能會(huì)降低人們?cè)诎察o狀態(tài)下主動(dòng)運(yùn)動(dòng)的意愿，我們?cè)诳請(qǐng)鲎灾骰顒?dòng)中也觀察到了CRS小鼠疲勞發(fā)生的這一變化，并于15d時(shí)變化顯著。如圖4所示，CRS會(huì)引起小鼠在空?qǐng)鲋械淖灾骰顒?dòng)路程和時(shí)間降低，在15d時(shí)其運(yùn)動(dòng)路程顯著降低（P<0.05），且通過中央?yún)^(qū)運(yùn)動(dòng)比率可以看出該變化與焦慮等情緒無關(guān)；CRS 10d和15d小鼠的空?qǐng)鲞\(yùn)動(dòng)時(shí)間顯著降低(P<0.05，0.05)。

圖4不同周期下CRS對(duì)ICR小鼠空?qǐng)鲋羞\(yùn)動(dòng)路程與時(shí)間的影響。（n＝12，Mean ± SEM），*P＜0.05。

3.4 不同CRS天數(shù)對(duì)ICR小鼠抓力的影響

由圖5可見，束縛引起的疲勞同樣能引起小鼠肌肉握力的降低。CRS 5d、10d和15d后小鼠握力均有降低，在5d和15dCRS組中握力顯著下降（P<0.05，P<0.001）。

圖5不同周期下CRS對(duì)ICR小鼠抓力的影響。（n＝12，Mean ± SEM），*P＜0.05; ***P＜0.001。

3.5 不同CRS天數(shù)對(duì)ICR小鼠疲勞相關(guān)生化指標(biāo)的影響

如圖所示，通過對(duì)小鼠束縛引起疲勞模型后對(duì)其血清和肝臟進(jìn)行疲勞相關(guān)生化指標(biāo)檢測(cè)，得到其肌糖原、肝糖原含量以及血清中血糖（Glu）、乳酸（LA）、肌酐（Cre）、尿素（Urea）、乳酸脫氫酶（LDH）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平。

在劇烈運(yùn)動(dòng)后會(huì)產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物，引起LA、Cre和Urea等大量堆積從而產(chǎn)生疲勞。如圖6所示，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)三組不同天數(shù)CRS小鼠游泳后的LA堆積均高于空白組，CRS10d和15d小鼠LA水平顯著高于空白組（P<0.001，P<0.001）。在運(yùn)動(dòng)中肌酸在肌肉內(nèi)供能，Cre為肌酸的終末代謝產(chǎn)物，疲勞小鼠中Cre將會(huì)升高。CRS后小鼠血清Cre含量均能被升高，在CRS10d和15d后，其Cre水平顯著升高（P<0.001，P<0.01）。尿素是蛋白質(zhì)分解代謝的產(chǎn)物，劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)供能不足，進(jìn)一步蛋白質(zhì)也會(huì)被分解供能，小鼠尿素升高。CRS組相比于空白組BUN水平均具有升高趨勢(shì)，其中CRS15d小鼠Urea顯著升高（P<0.05）。

圖6 不同周期下CRS對(duì)ICR小鼠血清乳酸、肌酐以及尿素的影響。（n＝12，Mean ± SEM），*P＜0.05; **P＜0.01; ***P＜0.001。

糖是運(yùn)動(dòng)的主要能量來源，機(jī)體通過糖的有氧氧化和無氧氧化產(chǎn)生能量生成ATP，機(jī)體疲勞往往伴隨著糖類能源物質(zhì)耗竭產(chǎn)生。如圖7所示，CRS小鼠的能源物質(zhì)水平進(jìn)一步下降，游泳運(yùn)動(dòng)后相比于空白組，CRS5d、10d和15d小鼠Glu水平均顯著降低（P<0.001，P<0.001，P<0.001）。CRS5d、10d和15d小鼠肝糖原水平也均顯著降低（P<0.001，P<0.05，P<0.05）。其肌糖原水平均顯著升高（P<0.01，P<0.01，P<0.05），該變化可能因其運(yùn)動(dòng)中肌肉利用肌糖原進(jìn)行糖酵解，產(chǎn)生更多乳酸堆積進(jìn)而抑制其肌糖原的利用。

圖7 不同周期下CRS對(duì)ICR小鼠血糖及肝糖原的影響。（n＝12，Mean ± SEM）， * P＜0.05; **P＜0.01; ***P＜0.001。

劇烈運(yùn)動(dòng)后產(chǎn)生大量自由基，通過氧化應(yīng)激損傷機(jī)體，且AST在心肌細(xì)胞中含量較多。由圖8可知，氧化應(yīng)激引起心肌細(xì)胞損傷，CRS小鼠運(yùn)動(dòng)后與空白組小鼠相比，血清AST增高，在CRS10d和15d小鼠中其水平顯著升高（P<0.05，P<0.01）。在劇烈運(yùn)動(dòng)后肌肉細(xì)胞因氧化應(yīng)激被破壞，LDH會(huì)滲入血中，CRS10d和15d小鼠LDH含量與空白組相比均顯著升高（P<0.05，P<0.05）。

圖8 不同周期下CRS對(duì)ICR小鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和乳酸脫氫酶的影響。（n＝12，Mean ± SEM），*P＜0.05; ** P＜0.01。

3.6 CRS致小鼠腓腸肌肌肉萎縮

為了研究CRS誘導(dǎo)小鼠疲勞發(fā)生的機(jī)制，我們對(duì)與運(yùn)動(dòng)耐力直接相關(guān)的骨骼肌進(jìn)行了研究。如圖9所示，與對(duì)照組相比，CRS處理15天后小鼠的腓腸肌重量顯著下降。通過H&E染色觀察腓腸肌，對(duì)照組小鼠腓腸肌肌纖維組織清晰、排列整齊，而CRS小鼠腓腸肌肌纖維形狀不規(guī)則、嚴(yán)重分裂形成多角型萎縮。定量分析顯示，CRS小鼠肌纖維的直徑和橫截面積顯著減少。數(shù)據(jù)表明，CRS可造成小鼠肌肉質(zhì)量降低并使肌纖維結(jié)構(gòu)受損。

圖9 CRS致小鼠腓腸肌萎縮（Mean ± SEM）。（a）小鼠腓腸肌組織解剖圖；（b）腓腸肌質(zhì)量；（c）代表性的腓腸肌H&E染色圖，比例尺：上圖500 μm，下圖100 μm；（d）和（e）腓腸肌纖維直徑和橫截面積（n＝3）。***P＜0.001。

3.7 CRS小鼠腓腸肌轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

為了系統(tǒng)地研究CRS對(duì)小鼠肌肉疲勞產(chǎn)生的影響，通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析了對(duì)照組和CRS處理15天小鼠的腓腸肌。在對(duì)照組與CRS組中共發(fā)現(xiàn)了239個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs）。其中CRS顯著上調(diào)了195個(gè)基因，顯著下調(diào)了44個(gè)基因(圖10a)。KEGG富集分析結(jié)果表明6-磷酸葡萄糖流向PPP，導(dǎo)致脂肪酸代謝代償性上調(diào)，以提供能量。與碳代謝相關(guān)的途徑，如戊糖磷酸途徑(PPP)、檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán))和丙酮酸代謝等被富集(圖10c)。并且結(jié)果顯示，與能量代謝密切相關(guān)的AMPK信號(hào)通路受到顯著調(diào)控?；贙EGG結(jié)果的熱圖顯示，與AMPK信號(hào)通路、脂肪酸代謝和碳代謝相關(guān)的基因均受到CRS處理的顯著調(diào)控(圖10b)。GO分子功能分析表明，氧化還原酶等分子活性被富集；細(xì)胞成分分析顯示，這些DEGs大量編碼線粒體蛋白；并且在生物過程中也富集了許多脂質(zhì)代謝過程相關(guān)的代謝途徑(圖10d)。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明，CRS致小鼠疲勞的原因與碳代謝、脂代謝途徑紊亂有關(guān)，并與主要供能細(xì)胞器線粒體及調(diào)控能量代謝的AMPK信號(hào)通路密切相關(guān)。

圖10 通過RNA-Seq分析CRS對(duì)小鼠腓腸肌基因表達(dá)的影響（mean ± SEM，n=3）。（a）腓腸肌中239個(gè)特異性DEGs的火山圖；（b）DEGs的KEGG富集分析；（c）AMPK信號(hào)通路、脂肪酸代謝和碳代謝相關(guān)的DEGs表達(dá)熱圖; （d）DEGs的GO富集分析。

3.8CRS誘導(dǎo)腓腸肌線粒體缺失和功能障礙與AMPK信號(hào)通路相關(guān)

線粒體在調(diào)節(jié)肌細(xì)胞能量供應(yīng)方面發(fā)揮著重要作用。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析的結(jié)果推測(cè)線粒體參與了CRS所導(dǎo)致的肌肉功能障礙。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)果，我們通過透射電鏡觀察腓腸肌的超微結(jié)構(gòu)。觀察發(fā)現(xiàn)對(duì)照組小鼠腓腸肌線粒體形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)，分布均勻；而CRS小鼠腓腸肌線粒體片段化、分布不均，線粒體總數(shù)減少。

線粒體標(biāo)志蛋白CYT-C和TOMM20的表達(dá)降低表明CRS顯著減少了線粒體的數(shù)量(圖11b)。此外，對(duì)氧化磷酸化蛋白（OXPHOS）進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)UQCRC2水平的顯著下降表明氧化磷酸化呼吸鏈?zhǔn)艿揭种啤Ｍㄟ^免疫組化染色觀察小鼠腓腸肌發(fā)現(xiàn)CRS小鼠MHY7表達(dá)顯著降低，同樣CRS處理使腓腸肌MYH7蛋白表達(dá)顯著降低，揭示了CRS減少了富含線粒體的I型骨骼肌纖維。

圖11CRS對(duì)小鼠腓腸肌線粒體功能障礙的影響（mean ± SEM，n=3）。（a）腓腸肌的透射電鏡圖；（b）腓腸肌中CTT-C、TOMM20、OXPHOS免疫印跡分析；（c）免疫印跡分析腓腸肌MYH7；（d）腓腸肌MYH7免疫組化染色，比例尺100 μm；（e-h）MYH7/GAPDH、CTT-C/GAPDH、TOMM20/GAPDH和UQCRC2/GAPDH的定量分析。*P＜0.05。

AMPK可以通過調(diào)節(jié)線粒體生物發(fā)生、融合/分裂和供能參與線粒體質(zhì)量控制。為了闡明CRS誘導(dǎo)的肌肉和線粒體功能障礙是否與AMPK有關(guān)，我們測(cè)定了相關(guān)蛋白的表達(dá)。如圖所示，與正常組相比，CRS引起小鼠腓腸肌p-AMPK/AMPK的水平顯著降低。并對(duì)其下游的主要蛋白進(jìn)行免疫印跡分析，發(fā)現(xiàn)PGC-1α及其下游因子TFAM的表達(dá)也顯著降低。因此，CRS誘導(dǎo)的腓腸肌線粒體功能障礙與AMPK/PGC-1α信號(hào)通路受阻相關(guān)。

圖12CRS對(duì)小鼠腓腸肌AMPK信號(hào)通路的影響（mean ± SEM，n=3）。（a）腓腸肌中p-AMPK、AMPK、PGC-1α和TFAM的免疫印跡分析；（b-d）p-AMPK/AMPK、PGC-1α/GAPDH和TFAM/GAPDH的定量分析。*P＜0.05，**P＜0.01。

3.9CRS對(duì)腓腸肌線粒體自噬的影響

線粒體自噬是清除受損線粒體的一種重要的線粒體質(zhì)量控制機(jī)制。與對(duì)照組相比，CRS處理后PINK1和LC3表達(dá)降低，p62表達(dá)升高，表明腓腸肌線粒體自噬受阻，線粒體受損并聚積。

進(jìn)一步對(duì)AMPK/mTOR信號(hào)通路進(jìn)行研究，探究其線粒體自噬受阻的原因。在CRS誘導(dǎo)的小鼠中，p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR表達(dá)顯著升高，p-ULK1 (Ser757)表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致ULK1與AMPK間的相互作用被破壞。綜上所述，CRS致小鼠腓腸肌AMPK激活受阻，從而使mTOR途徑異常激活抑制保護(hù)性線粒體自噬的發(fā)生。

圖13 CRS對(duì)腓腸肌線粒體自噬的影響（mean ± SEM，n=3）。（a）腓腸肌中PINK1、LC3和p62的免疫印跡分析；（b）p-AKT/AKT (f)、p-mTOR/mTOR (g)和p-ULK1 (Ser757) 的免疫印跡分析；（c-h）PINK1/GAPDH、LC3-Ⅱ/GAPDH、p62/GAPDH、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR和p-ULK1 (Ser757)/GAPDH的定量分析。*P＜0.05，**P＜0.01。

3.10蓮須提取物對(duì)CRS小鼠負(fù)重游泳的影響

結(jié)果如圖所示，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠在CRS處理15天后負(fù)重游泳首次連續(xù)下沉?xí)r刻顯著延后。紅景天和蓮須給藥各組較模型組首次連續(xù)下沉?xí)r刻延長，且蓮須給藥組的低和高劑量組與模型組相比有顯著性差異。在游泳耐力上，較空白對(duì)照組相比，模型組力竭時(shí)間顯著縮短。紅景天何蓮須給藥各組較模型組力竭時(shí)間延長，且蓮須給藥組的高劑量組與模型組相比顯著提高。

圖14 蓮須提取物對(duì)CRS小鼠負(fù)重游泳首次連續(xù)下沉?xí)r刻和力竭時(shí)間的影響。（n＝10-12，Mean ± SEM），與正常組相比，**P＜0.01，***P＜0.001；與模型組相比，p<0.05，#p<0.001。LSL：thelowdoseofLotus Stamen，蓮須低劑量組（0.5 g/kg），LSH：thehighdoseofLotus Stamen，蓮須高劑量組（1g/kg），Rho：Rhodiola，紅景天組。

3.11蓮須提取物對(duì)CRS小鼠抓力的影響

結(jié)果如圖所示，在造模15天后，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠在CRS刺激15天后抓力顯著降低。蓮須和紅景天給藥各組較模型組抓力均顯著升高。

圖15 蓮須提取物對(duì)CRS小鼠抓力的影響。（n＝12，Mean ± SEM），與正常組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#p<0.05。LSL：thelowdoseofLotus Stamen，蓮須低劑量組（0.5 g/kg），LSH：thehighdoseofLotus Stamen，蓮須高劑量組（1g/kg），Rho：Rhodiola，紅景天組。

3.12蓮須提取物對(duì)CRS小鼠疲勞相關(guān)生化指標(biāo)的影響

結(jié)果如圖所示，在造模15天后，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠在CRS刺激15天后血清Glu顯著降低，LDH、LA和CORT顯著升高。蓮須和紅景天給藥各組較模型組抓力均能顯著恢復(fù)。

圖16 蓮須提取物對(duì)CRS小鼠疲勞相關(guān)生化指標(biāo)的影響。（Mean ± SEM），與正常組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#p<0.05。LSL：thelowdoseofLotus Stamen，蓮須低劑量組（0.5 g/kg），LSH：thehighdoseofLotus Stamen，蓮須高劑量組（1g/kg），Rho：Rhodiola，紅景天組。

1 實(shí)驗(yàn)材料 1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

ICR雄鼠12x4=48只（購自北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司），4周齡，體重21-23g，許可證號(hào)：SCXK（京）2017-0020。動(dòng)物購入后于SPF級(jí)動(dòng)物房中飼養(yǎng)。自由進(jìn)食給水，保持實(shí)驗(yàn)室安靜，實(shí)驗(yàn)室溫度22-25oC，濕度50-60%，明暗周期12h/12h。

1.2實(shí)驗(yàn)材料

乳酸（LD）試劑盒（南京建成：20191102）；?。翁窃噭┖校暇┙ǔ桑?0191102）；乳酸脫氫酶測(cè)定試劑盒（中生北控：190771）；葡萄糖測(cè)定試劑盒（中生北控：190871）；肌酐測(cè)定試劑盒（中生北控：190721）；尿素測(cè)定試劑盒（中生北控：190971）；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測(cè)定試劑盒（中生北控：190841）；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測(cè)定試劑盒（中生北控：190821）。

小鼠束縛器（直徑3cm，長度7.5cm）；小鼠負(fù)重游泳測(cè)試分析系統(tǒng)（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所）；大小鼠抓力儀（YLS-13A，濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司）；小鼠自主活動(dòng)計(jì)算機(jī)在線檢測(cè)系統(tǒng)（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所）；酶標(biāo)儀；全自動(dòng)生化儀（Beckman AV480）。

2 實(shí)驗(yàn)方法 2.1分組及實(shí)驗(yàn)

適應(yīng)性飼養(yǎng)4d，根據(jù)體重將動(dòng)物隨機(jī)分為以下4組（n=12）。①組為空白組，④組于第1d開始進(jìn)行束縛，③組于第6d開始進(jìn)行束縛，②組于第11d開始進(jìn)行束縛。于第16d各組分別完成0、5、10、15d的慢性束縛應(yīng)激，各組動(dòng)物于同一天進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)。

CRS組每天束縛8小時(shí)（12:00-20:00）。實(shí)驗(yàn)期間記錄小鼠體重，在第16d進(jìn)行空?qǐng)鰴z測(cè)及負(fù)重強(qiáng)迫游泳，次日進(jìn)行抓力測(cè)試和取材。

2.2行為學(xué)檢測(cè) 2.2.1抓力測(cè)試（Gripstrength）

第16天測(cè)試小鼠前肢肌肉力量。將小鼠置于大小鼠握力儀上，小鼠前肢握住握力儀，輕輕牽拉小鼠尾部，將會(huì)產(chǎn)生反作用力。逐漸增大拉力直到動(dòng)物松爪，握力儀高精度力量傳感器將會(huì)記錄下最大拉力，每只小鼠測(cè)量3次取平均值。

2.2.2空?qǐng)鰧?shí)驗(yàn)（Open-field）

將小鼠放入自主活動(dòng)測(cè)試儀（長寬各30 cm，高60 cm）中適應(yīng)環(huán)境3min，然后開始記錄其在5min內(nèi)的活動(dòng)總路程、運(yùn)動(dòng)路程、運(yùn)動(dòng)時(shí)間、平均速率、中央?yún)^(qū)運(yùn)動(dòng)路程比率等指標(biāo)。

2.2.3負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)（Exhaustive swimming test）

小鼠負(fù)重游泳測(cè)試分析系統(tǒng)通常用來測(cè)試小鼠疲勞情況，通過負(fù)重后在水中的游泳行為來考察其體力情況。儀器包括電腦、水箱、攝像頭三個(gè)部分，負(fù)重游泳測(cè)試系統(tǒng)共四個(gè)泳道，可供4只小鼠同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

第16天將小鼠置于獨(dú)立自動(dòng)檢測(cè)的游泳箱中游泳，水溫(25±0.5)°C，水深≥25cm。將小鼠尾部附上8%重量后，通過前端和上方兩個(gè)攝像頭實(shí)時(shí)記錄小鼠自游泳開始至力竭時(shí)間段內(nèi)的行為。小鼠頭部沉入水中后7s仍不能返回水面時(shí)，判斷為力竭，測(cè)試終止。記錄首次下沉?xí)r間、首次連續(xù)下沉?xí)r刻、下沉次數(shù)、水上以及水下運(yùn)動(dòng)時(shí)間和不動(dòng)時(shí)間以及力竭時(shí)間等。游泳結(jié)束后，立即撈出小鼠，擦干小鼠身上的水分，放回原來的籠中。

2.3 取材及生化檢測(cè)

準(zhǔn)確計(jì)時(shí)游泳30min后，休息30min，然后在戊巴比妥鈉麻醉下取血、肝臟、肌肉（腓腸?。┙M織用于后期生化指標(biāo)測(cè)量。取得血靜置4h后，3500r/ min，15min離心得血清。

使用南京建成乳酸試劑盒，?。翁窃噭┖邪凑赵噭┖袃?nèi)說明書方法操作對(duì)血清乳酸以及肝臟進(jìn)行檢測(cè)，得到所有小鼠的血乳酸、肌糖原和肝糖原含量。使用中生北控乳酸脫氫酶測(cè)定試劑盒；葡萄糖測(cè)定試劑盒；肌酐測(cè)定試劑盒；尿素測(cè)定試劑盒；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測(cè)定試劑盒；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測(cè)定試劑盒，通過全自動(dòng)生化儀檢測(cè)小鼠血清肌酐（Cre）、尿素（Urea）、血糖（Glu）、乳酸脫氫酶（LDH）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平。

2.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean ± SEM）表示，采用SPSS 25.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P < 0.05為產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1. 目的

通過慢性束縛應(yīng)激的方法，構(gòu)建能夠很好模擬當(dāng)今社會(huì)人們所處的工作環(huán)境和生活狀態(tài)而引起的“亞健康”體力疲勞：如長期伏案或在有限空間內(nèi)工作、缺少運(yùn)動(dòng)、以及工作和生活所帶來的生理和心理壓力等等，以用于抗體力疲勞藥品和保健品的功效評(píng)價(jià)。

2. 意義

隨著社會(huì)的進(jìn)步和高速發(fā)展，人們的生活節(jié)奏日益加快，所面臨的社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)也隨之加大，長期處在生活和工作壓力下，身體容易出現(xiàn)精力不夠、注意力不集中、疲憊乏力甚至酸痛等的疲勞狀況。當(dāng)今，疲勞已成為廣泛存在且不容忽視的健康問題。隨著生活水平的提高，人們對(duì)保健品的需求也在不斷增大，通過服用具有緩解體力疲勞的保健品可以降低或消除機(jī)體的疲勞現(xiàn)象，使其體力恢復(fù)到正常。因此, 建立穩(wěn)定的體力疲勞動(dòng)物模型和功效評(píng)價(jià)方法就顯得尤為重要。目前常用的方法是采用正常動(dòng)物通過強(qiáng)迫運(yùn)動(dòng)而造成其急性體力疲勞，而非真正的疲勞動(dòng)物模型。隨著社會(huì)的進(jìn)步，人們的生活習(xí)慣和工作性質(zhì)發(fā)生了很大改變，高自動(dòng)化的機(jī)械設(shè)備替代了原來完全靠人工進(jìn)行的強(qiáng)體力勞動(dòng)，因此疲勞的表現(xiàn)也有了很大的不同。本研究采用慢性束縛應(yīng)激(CRS)的方法，將動(dòng)物限制在狹窄空間內(nèi)無法自由活動(dòng)而造成體力疲勞，能很好地模擬當(dāng)今人們因長期應(yīng)激所導(dǎo)致的“亞健康”狀態(tài)的體力疲勞狀態(tài)，如長期伏案或在有限空間內(nèi)工作、缺少運(yùn)動(dòng)、睡眠不足、以及工作和生活所帶來的生理和心理壓力等。

3. 國內(nèi)外研究進(jìn)展

國內(nèi)外文獻(xiàn)中已報(bào)道的造成體力疲勞動(dòng)物模型的方法有：強(qiáng)迫運(yùn)動(dòng)、應(yīng)激、化學(xué)、免疫和炎癥、放射線、手術(shù)、基因工程和癌因等單一因素或多種因素誘導(dǎo)的方法構(gòu)建的一系列用于疲勞研究的動(dòng)物模型[1]。而在這些方法中，強(qiáng)迫運(yùn)動(dòng)法是最為常用的造成體力疲勞的方法，如強(qiáng)迫游泳、轉(zhuǎn)輪攀爬、跑步等。我國原衛(wèi)生部于2003年印發(fā)的《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003年版）中的“緩解體力疲勞”保健品功能評(píng)價(jià)方法是采用的負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)。除此之外，文獻(xiàn)中亦有采用束縛、睡眠干擾、或多種刺激因素相結(jié)合的（電擊、冰水刺激、噪聲刺激、）應(yīng)激方法導(dǎo)致的動(dòng)物疲勞[1]。如：Tanaka等對(duì)SD大鼠進(jìn)行睡眠干擾5天，就可導(dǎo)致其負(fù)重游泳力竭時(shí)間縮短等疲勞樣行為[2]；Park等[3]將雄性C57BL/6J小鼠置于與其緊密接觸且無法活動(dòng)的圓柱形束縛器（長10 cm，直徑3 cm）中，每天束縛3 h，共15天可造成小鼠在空?qǐng)鲋凶灾骰顒?dòng)降低和強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間延長等疲勞癥狀[3]。為了模擬人們?cè)谌粘－h(huán)境中所受到的復(fù)雜因素影響，可同時(shí)使用上述物理方法進(jìn)行多重刺激從而造成動(dòng)物疲勞的模型, Zou等采用電擊、冰水游泳和束縛刺激多因素刺激23天造成SD大鼠轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)降低、自主活動(dòng)減少等疲勞現(xiàn)象[4]；Shao等采用束縛、強(qiáng)迫運(yùn)動(dòng)、擁擠環(huán)境飼養(yǎng)和嘈雜聲中暴露4種方法想結(jié)合成功誘導(dǎo)了SD大鼠的疲勞模型[5]；Zhao等采用睡眠剝奪、強(qiáng)迫游泳、束縛和夾尾造成小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間縮短和空?qǐng)鲎灾骰顒?dòng)降低等疲勞癥狀[6]。盡管這些誘導(dǎo)疲勞的方法能夠模擬當(dāng)今人們的生活工作狀態(tài)，但因?yàn)闆]有動(dòng)態(tài)觀察和比較動(dòng)物出現(xiàn)疲勞現(xiàn)象的最佳時(shí)機(jī)，造模參數(shù)各異。

我們采用ICR、C57BL/6N或BALB/C雄性小鼠，每天對(duì)其束縛8小時(shí)、連續(xù)束縛15天可穩(wěn)定造成其體力疲勞，表現(xiàn)在強(qiáng)迫游泳首次連續(xù)下沉?xí)r刻明顯提前、力竭時(shí)間顯著縮短、自主活動(dòng)和抓力明顯降低；肝糖原和血尿素氮水平降低、血乳酸和肌糖原水平升高。并揭示該疲勞的發(fā)生與腸道微生物失衡和犬尿氨酸代謝紊亂、腓腸肌肌肉功能障礙有關(guān)。腓腸肌肌肉功能障礙可能涉及由AMPK信號(hào)通路介導(dǎo)的肌肉線粒體功能損傷以及自噬受阻的能量代謝失衡而產(chǎn)生。

參考文獻(xiàn)：

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3)Park, S. H.; Jang, S.; Lee, S. W.; Park, S. D.; Sung, Y. Y.; Kim, H. K., Akebia quinata Decaisne aqueous extract acts as a novel anti-fatigue agent in mice exposed to chronic restraint stress. J Ethnopharmacol 2018, 222, 270-279.

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