1.評(píng)價(jià)指標(biāo)體系

1.1行為學(xué)評(píng)分：通過大鼠神經(jīng)損傷嚴(yán)重缺損評(píng)分（Neurological Severity Scores, NSS）對(duì)其前肢屈曲情況、肌張力、神經(jīng)損傷情況進(jìn)行評(píng)價(jià)。分?jǐn)?shù)越高，動(dòng)物的行為障礙越嚴(yán)重，缺血引起的神經(jīng)損傷越嚴(yán)重。

①提鼠尾觀察前肢屈曲情況，如雙前肢對(duì)稱伸向地面計(jì)為0分，如手術(shù)的對(duì)側(cè)前肢出現(xiàn)腕屈、肘屈曲計(jì)為1分，肩內(nèi)旋計(jì)為2分，既有腕射屈曲又有肩內(nèi)旋者計(jì)為3分；②將動(dòng)物雙前肢置于金屬網(wǎng)上，觀察雙前肢的肌張力。雙前肢肌張力對(duì)等且有力者計(jì)為0分，同樣根據(jù)手術(shù)對(duì)側(cè)肢張力下降程度不同計(jì)為1、2、3分；③動(dòng)物有不停向一側(cè)轉(zhuǎn)圈者，根據(jù)轉(zhuǎn)圈情況計(jì)為0-3分。

1.2TTC染色

1.3HE病理染色

2. 國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有模型的異同

3. 技術(shù)難點(diǎn)

（1）手術(shù)難度：本實(shí)驗(yàn)室采用永久性大腦中動(dòng)脈阻塞模型，該手術(shù)癥狀嚴(yán)重，若操作不熟練則動(dòng)物死亡率較高，具有很大的難度，對(duì)操作人員具有很高的要求。

4. 創(chuàng)新性

5. 應(yīng)用價(jià)值

本研究在SD大鼠上建立永久性缺血性腦卒中模型并進(jìn)行了評(píng)價(jià)，可以用于藥物的篩選和機(jī)制探究。

動(dòng)物飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所的屏障環(huán)境，12 h 照明/12 h 黑暗( 照明: 8: 00-20:00) ，飼養(yǎng)期間給予動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)飼料和潔凈飲水。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵守國(guó)際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求。

3.1動(dòng)物基本情況

與假手術(shù)組相比，模型組動(dòng)物精神萎靡，進(jìn)食量減少，活動(dòng)減少，存活率如圖1所示。

圖1 各組動(dòng)物造模后24、48、72h存活率

3.2動(dòng)物神經(jīng)損傷評(píng)價(jià)

由圖2可見，與Sham組比較，模型組大鼠前肢屈曲、肌張力和轉(zhuǎn)圈情況逐漸加重。如圖3所示，模型組大鼠3天行為總分顯著升高(P<0.001)，提示腦缺血可誘發(fā)異常行為和運(yùn)動(dòng)，統(tǒng)計(jì)第3天總得分與第1天總得分的差異以評(píng)價(jià)疾病進(jìn)程，如圖所示，模型組大鼠運(yùn)動(dòng)能力在第3天顯著下降(P<0.001)。

圖2各組大鼠前肢屈曲、肌張力、轉(zhuǎn)圈情況

圖3各組大鼠行為學(xué)總分統(tǒng)計(jì)及第3天得分與第1天得分差異

3.3TTC評(píng)價(jià)腦組織梗死率

圖4 動(dòng)物腦組織梗死率

TTC可將正常腦組織染成紅色，而將梗死區(qū)染成白色。如圖4所示，與Sham組相比，模型組梗死面積明顯增大(P<0.001)。

3.4動(dòng)物腦組織病理變化

由圖5可見，模型組動(dòng)物皮層和海馬體CA1、CA3、DG區(qū)可見組織結(jié)構(gòu)變化，細(xì)胞丟失嚴(yán)重。

圖5動(dòng)物腦組織HE染色

4討論和小結(jié)

缺血性腦卒中仍是威脅人類健康的疾病，臨床上有藥物治療、去骨瓣減壓術(shù)、介入治療等方法對(duì)腦卒中進(jìn)行治療，主要非介入治療方法是針對(duì)急性期的血液循環(huán)障礙和神經(jīng)元毒性采取的溶栓、抗炎抗氧化和減輕腦血腫水腫等措施控制繼發(fā)性腦損傷，腦血流的快速恢復(fù)是缺血性腦卒中的首選治療方法，是降低其病死率、致殘率的重要手段之一。卒中診療受到越來越多的重視，尋找有效的治療策略對(duì)缺血性卒中的預(yù)后極為重要。目前，越來越多的學(xué)者致力于天然藥物抗腦缺血再灌注損傷的研究，特別是植物源性天然藥物具有多種有益作用。

本研究在SD大鼠上建立永久性缺血性腦卒中模型并進(jìn)行了評(píng)價(jià)，可以用于藥物的篩選和機(jī)制探究。

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠12只（購自北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司），8周齡，體重280-330g，許可證號(hào)：SCXK2017-0005。動(dòng)物購入后于SPF級(jí)動(dòng)物房中飼養(yǎng)。自由進(jìn)食給水，保持實(shí)驗(yàn)室安靜，實(shí)驗(yàn)室溫度22-25oC，濕度50-60%，明暗周期12h/12h。

1.2實(shí)驗(yàn)材料

手術(shù)器械購于上海醫(yī)療器械(集團(tuán))有限公司手術(shù)器械廠；線栓購于北京西濃科技有限公司；TTC購于上海希格瑪高技術(shù)有限公司。

2實(shí)驗(yàn)方法 2.1分組及

造模方法

適應(yīng)性飼養(yǎng)4天，根據(jù)體重將動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組（n=6）和模型組（n=6），各組于第5天分別完成假手術(shù)和造模處理，并在第5、6、7天進(jìn)行行為學(xué)評(píng)價(jià)。 所有大鼠在術(shù)前禁食12h，自由飲水。動(dòng)物稱重后，用異氟烷氣體麻醉（5%深度麻醉，2% 維持麻醉），備皮，仰臥固定于鼠板。頸部正中切開皮膚，鈍性分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，仔細(xì)分離避免損傷迷走神經(jīng)。向內(nèi)找到頸總動(dòng)脈（CCA），分離至血管表明光滑在CCA上墊兩根線，遠(yuǎn)心端系一個(gè)活扣，兩根線之間的距離盡量拉大；向遠(yuǎn)心端找到頸外動(dòng)脈（ECA），穿線，結(jié)扎；用動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）。用眼科鑷挑起CCA，用顯微彈簧剪在兩段線中間剪一小口；用眼科鑷插入直徑0.23~0.26mm的線拴，插到ICA血管夾位置后，系緊CCA遠(yuǎn)心端的活扣以固定線拴，打開ICA上的血管夾；繼續(xù)插入線拴，直到(18±0.5)mm標(biāo)記處，微遇阻力時(shí)停止。縛緊活扣，剪去多余的線頭和線拴尾部；用生理鹽水溶解青霉素鈉粉末，用注射器吸取青霉素鈉液體，沖洗頸部傷口，將腺體推入肌肉筋膜內(nèi)層，縫合肌肉；將注射器針頭伸入縫合的肌肉縫隙中，推注青霉素鈉液體，清理后縫合皮部。假手術(shù)組大鼠只分離暴露頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈。造模結(jié)束后，保留線栓至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，造成大鼠永久性缺血性腦卒中模型。

2.2觀察和行為學(xué)檢測(cè) 2.2.1 一般觀察

記錄動(dòng)物體重，觀察動(dòng)物毛發(fā)、精神狀態(tài)和動(dòng)作靈活性等一般外在形態(tài)，記錄各組存活率。

2.2.2大鼠神經(jīng)損傷嚴(yán)重缺損評(píng)分（Neurological Severity Scores, NSS）

造模24h、48h、72h后進(jìn)行評(píng)分，如下。

①提鼠尾觀察前肢屈曲情況，如雙前肢對(duì)稱伸向地面計(jì)為0分，如手術(shù)的對(duì)側(cè)前肢出現(xiàn)腕屈、肘屈曲計(jì)為1分，肩內(nèi)旋計(jì)為2分，既有腕射屈曲又有肩內(nèi)旋者計(jì)為3分；②將動(dòng)物雙前肢置于金屬網(wǎng)上，觀察雙前肢的肌張力。雙前肢肌張力對(duì)等且有力者計(jì)為0分，同樣根據(jù)手術(shù)對(duì)側(cè)肢張力下降程度不同計(jì)為1、2、3分；③動(dòng)物有不停向一側(cè)轉(zhuǎn)圈者，根據(jù)轉(zhuǎn)圈情況計(jì)為0-3分。分?jǐn)?shù)越高，動(dòng)物的行為障礙越嚴(yán)重。

2.3取材及TTC染色

1.取腦組織：剪去右心耳后用預(yù)冷的生理鹽水灌流，斷頭處死（約耳后處），用剪刀縱向剪開皮膚和肌肉，暴露頭骨，將頭骨向兩側(cè)輕輕掰開，用眼科鑷夾斷視神經(jīng)，剝離完整的嗅球、大腦和小腦，放入培養(yǎng)皿，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗；

2.切片：腦組織擺放入大鼠腦模具后，用單面刀片進(jìn)行切片，每隔2mm切一片，視神經(jīng)分叉處插入第一支刀片，向上切2片，向下切4片；

3.染色：將切片置于裝有2% TTC染液的避光的六孔板中，置于37°C水浴鍋中孵育，每5min翻面以保證充分接觸染液，孵育20min后放入4%多聚甲醛固定30min；

4.拍照：固定后取出置于黑色容器上，用濾紙吸去邊緣水分，正反面分別拍照；

5.梗死面積統(tǒng)計(jì)：借助Image J測(cè)定梗死面積；計(jì)算梗死率，梗死率=（雙面梗死總面積/雙面腦切片總面積）×100%。

2.4HE染色

（1）預(yù)處理過程

使用常規(guī)方法對(duì)切片進(jìn)行脫蠟，再水合，在二甲苯中浸泡5min，重復(fù)兩次，用無水乙醇浸泡5min，再在95%乙醇中浸泡5min，在85%乙醇中浸泡5min，在70%乙醇中浸泡5min，最后用PBS浸洗3min共3次。

（2）染色步驟

首先，將切片浸入試劑盒中的試劑一（核染液）染缸中染色3-5min，用水洗約30-60s；

其次，將洗滌后的切片浸入試劑二（分色液I）中約20s后用水洗約30-60s；

再次，將洗滌后的切片浸入試劑三（分色液II）中約40s后用水洗約30-60s；

最后，將洗滌后的切片置于試劑 死漿染液中進(jìn)行染色，2min后再用試劑五（增色液）洗去多余的染液，共洗2次，用濾紙吸干試劑，封片進(jìn)行鏡檢。

2.5 數(shù)據(jù)分析

采用 Graphpad Prism 9. 0，組間比較使用單因素方差分析或獨(dú)立樣本 t 檢驗(yàn)。

1. 目的

缺血性卒中( Cerebral Ischemic Stroke，CIS) 是由腦的供血?jiǎng)用}狹窄或閉塞、腦供血不足導(dǎo)致腦組織壞死的總稱。統(tǒng)計(jì)資料表明，我國(guó)腦卒中的死亡率是歐美國(guó)家的4～5倍、日本的3.5倍；每年新發(fā)病例數(shù)超過200萬，死亡人數(shù)超過百萬。通過線栓法構(gòu)建能夠很好模擬老年或有動(dòng)脈粥樣硬化等基礎(chǔ)疾病的人群突發(fā)的高死亡率、預(yù)后較差的缺血性腦卒中，可用于缺血性卒中血管損傷的藥效評(píng)價(jià)。

2. 意義

腦卒中是疾病負(fù)擔(dān)的主要原因[1]，缺血性腦卒中占腦血管病的80%左右[2]，主要因腦血管局部動(dòng)脈粥樣硬化、血栓脫落及血管損傷等導(dǎo)致腦供血?jiǎng)用}栓塞，從而引起相應(yīng)腦組織缺血、壞死，具有患病率高、復(fù)發(fā)率高、死亡率高等特點(diǎn)，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量[3]。2021年發(fā)表的《中國(guó)腦卒中15年變化趨勢(shì)和特點(diǎn)》[4]顯示，在過去的近多年中，我國(guó)腦卒中現(xiàn)患人數(shù)高居世界首位，患病率呈上升趨勢(shì)且趨于年輕化，經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)持續(xù)加重。

3. 國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展

國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中已報(bào)道的造成體力疲勞動(dòng)物模型的方法有：線栓法、光化學(xué)誘導(dǎo)法、開顱法、雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎等方法構(gòu)建的一系列用于缺血性腦卒中的動(dòng)物模型，其中，線栓法是最為常用的方法，具體操作為將一根特制的線栓沿頸總動(dòng)脈或頸外動(dòng)脈向內(nèi)插入直至堵塞大腦中動(dòng)脈，針對(duì)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康目烧{(diào)整具體的缺血和再灌注時(shí)間等，如有短暫大腦中動(dòng)脈閉塞、缺血再灌注損傷、永久性大腦中動(dòng)脈阻塞等。 我們采用雄性SD大鼠，通過線栓法建立永久性缺血性腦卒中模型，造模后連續(xù)3天觀察并記錄動(dòng)物狀態(tài)、體重、行為學(xué)，并在造模后第3天借助TTC染色評(píng)價(jià)動(dòng)物腦組織梗死面積，通過HE染色觀察腦組織病理變化。

參考文獻(xiàn)：

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[2] Randolph SA. Ischemic Stroke. Workplace Health & Safety. 2016, 64(9): 444.

[3] 《中國(guó)腦卒中防治報(bào)告2019》概要[J].中國(guó)腦血管病雜志,2020,17(05):272-281.

[4] 王亞楠,吳思緲,劉鳴.中國(guó)腦卒中15年變化趨勢(shì)和特點(diǎn)[J].華西醫(yī)學(xué),2021,36(06):803-807.