滾筒式睡眠干擾法可模擬睡眠剝奪致小鼠學習記憶障礙，在物體位置識別實驗、新物體識別實驗和Morris水迷宮實驗等認知行為學檢測中均有體現(xiàn)。物體認知實驗是基于嚙齒類動物先天對新物體更加具有探索傾向性的原理而建立, 它無需對動物進行任何刺激, 使其在自由狀態(tài)下進行學習, 更加貼近人類的學習記憶行為, 用于評價動物的短時學習記憶能力。作為其中一種實驗模式的物體位置識別實驗則主要用于反應動物的短時、空間記憶能力，而新物體識別實驗則主要反映動物的短時、非空間學習記憶能力。采用本造模方法可使小鼠在物體位置識別實驗中的相對辨別指數(shù)顯著下降，說明模型小鼠的短時、空間記憶能力受損。新物體識別實驗中發(fā)現(xiàn)模型小鼠在測試期的相對辨別指數(shù)明顯下降，表明睡眠干擾可破壞小鼠的短時、非空間記憶能力。Morris水迷宮實驗則是一種經(jīng)典的海馬依賴性認知行為檢測方法, 被廣泛用于空間認知能力的評價, 主要包括定位航行、空間探索、工作記憶等模式, 能反應長時、空間參考記憶能力。經(jīng)過睡眠干擾14天后小鼠在水迷宮定位航行中的學習能力有所下降，表現(xiàn)為從第3天開始連續(xù)3天的尋臺潛伏期均顯著延長，而且在空間探索階段中的穿臺次數(shù)明顯減少，表明模型小鼠的空間參考記憶能力顯著下降。以上行為學分析結(jié)果顯示，滾筒式睡眠干擾儀可誘導小鼠的學習記憶障礙。

睡眠干擾被認為會引起一些腦區(qū)的氧化應激反應, 進而導致認知功能損傷, 引起學習記憶障礙。大量的活性氧自由基（reactive oxygen species, ROS）的產(chǎn)生能通過酶失活、脂質(zhì)過氧化、DNA修飾等一系列變化造成神經(jīng)元損傷, 進而最終導致認知功能障礙。機體為了防御這種應激損傷, 建立了一套完整的抗氧化酶防御自由基損傷系統(tǒng), 如抗氧化酶SOD、GPX、過氧化物酶（catalase,CAT）和非酶類抗氧化物GSH等。總抗氧化能力（T-AOC）可以用來反應氧化應激水平, 而MDA則是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物, 被廣泛認為是ROS引起損傷的生物標志物之一。鑒于腦內(nèi)的皮層和海馬在維持正常認知功能中的重要作用, 我們首先對小鼠該兩個腦區(qū)內(nèi)的T-AOC、SOD、MDA和GSH這四種氧化應激生物標志物的水平進行考察, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過睡眠干擾14天后模型小鼠皮層和海馬內(nèi)的T-AOC、SOD和GSH活性均不同程度的顯著下降, 而MDA水平則明顯升高, 即模型小鼠腦內(nèi)的氧化應激水平升高。除氧化應激之外, 近年來越來越多研究發(fā)現(xiàn)睡眠干擾導致的學習記憶障礙與引起機體炎性反應。睡眠干擾可顯著升高促炎細胞因子（IL-1β、TNF-α、IL-6）的水平, 炎性反應同樣是神經(jīng)退行性疾病的重要發(fā)病機制之一。

模型技術(shù)難點在于1-對滾筒內(nèi)的動物頻繁取出放回需要技巧，以保證可均衡性取出動物用于檢測，從而避免動物長時間脫離睡眠干擾狀態(tài)，產(chǎn)生功能性恢復；2-與其他應激方式不同，滾筒式睡眠干擾通過物理性剝奪動物的睡眠，模擬睡眠障礙效應，除整體動物行為學檢測之外，可進一步結(jié)合電生理、組織病理學等深入探討睡眠干擾對抑郁、焦慮、運動功能等影響，為全面防護睡眠干擾所致功能性損傷提供技術(shù)和模型儲備。

本實驗采用健康成年SPF級小鼠。飼料墊料均為高壓滅菌產(chǎn)品，購自北京維通利華實驗動物有限公司，動物用水均經(jīng)過除菌處理。飼養(yǎng)及實驗操作均于具有檢驗合格資質(zhì)的SPF級屏障動物室內(nèi)進行，并且實驗動物以完整的包裝直接進入屏障實驗室，觀察適應7天后無異常情況，方進行實驗。實驗過程中動物操作均符合動物倫理學規(guī)范，對環(huán)境和生態(tài)影響等符合國家相關(guān)法律規(guī)定。

1材料

（1）試劑：小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫分析測試盒、小鼠白細胞介素6（IL-6）酶聯(lián)免疫分析測試盒和小鼠白細胞介素IL- 1β（IL-1β）酶聯(lián)免疫分析測試盒（R&D公司，USA），小鼠總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒和還原型谷胱甘肽（GSH）試劑盒（南京建成生物工程研究所，中國江蘇）

（2）儀器：

①行為學檢測：小鼠空場實驗實時檢測系統(tǒng)、物體認知實驗檢測裝置、小鼠Morris水迷宮實時在線檢測分析系統(tǒng)

②氧化應激、炎性因子相關(guān)指標檢測：電熱恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械五廠）、電熱溫培養(yǎng)箱（上海科學儀器有限公司）、低溫高速離心機、移液槍（德國Eppendorf公司）、全自動波長多功能酶標儀（瑞士 Tecan 公司）。

2評價方法

（1）行為學評價:

①空場實驗

空場實驗發(fā)生于小鼠多功能空場實時檢測裝置內(nèi), 用于檢測動物的自主活動情況。該儀器由4個（30 cm × 28 cm × 35 cm）箱體組成,每個箱子上方有 120 Lux 的光源, 并有攝像頭對動物的運動進行監(jiān)測。檢測當天取出對照組和睡眠干擾儀內(nèi)模型組小鼠后, 將小鼠置于空場測試箱的中央, 先適應3 min, 隨后系統(tǒng)實時在線軟件自動記錄接下來10 min內(nèi)小鼠的總路程和平均速度, 作為評價自主活動的指標。每次實驗結(jié)束后, 用75% 酒精擦洗箱體底板, 避免氣味對動物產(chǎn)生影響。

② 物體位置識別實驗

物體位置識別實驗用于評價動物的短時空間記憶能力, 發(fā)生于物體認知檢測裝置。該裝置由4個黑色聚酯塑料材質(zhì)構(gòu)成的封閉箱（60 cm × 40 cm × 80 cm）構(gòu)成, 箱體左右兩側(cè)各有兩排LED燈條照明, 頂部采用攝像頭觀察動物的活動情況及探索過程。箱體內(nèi)部使用黑色PVC材料, 箱底板噴以黑色啞光漆并用砂紙打磨以避免反光, 底板可抽出便于清洗動物殘屑物。

實驗包括3個階段：適應期、熟悉期和測試期。適應期為期3天,將動物背對箱體依次放入實驗箱中部位置使之自由活動, 10 min/只/d, 1 次/d。適應結(jié)束后, 次日進行熟悉期和測試期。熟悉期時, 將兩個完全相同的物體放入實驗箱內(nèi)相鄰的磁鐵處固定, 記錄小鼠5 min內(nèi)對兩物體的探索行為, 比較動物對熟悉物體A1和熟悉物體A2的探索時間來評價動物對物體所在位置是否存在偏愛性, 用動物對物體對的總探索時間來評價動物對兩物體的總探索能力是否處于同一水平。間隔30 min后開始測試期, 將其中一個熟悉物體改變位置, 移動至新的位置。記錄小鼠在5 min的測試期內(nèi)分別對變化位置后物體（“新物體”）（TN）和原熟悉物體的探索時間（TF）, 用相對辨別指數(shù)（discrimination index, DI）來評價動物的記憶能力。相對辨別指數(shù)計算公式為DI =(TN-TF)/(TN+TF)。

③ 新物體識別實驗

新物體識別實驗同樣發(fā)生于物體識別系統(tǒng)內(nèi), 實驗流程同樣包括3個階段: 適應期（10 min/d, 連續(xù)3d）;熟悉期（5 min）和測試期（5 min）。其中適應期和熟悉期的實驗步驟同物體位置識別實驗一樣, 只是測試期時有所不同: 在新物體識別實驗的測試期, 將其中一個熟悉物體變換為新物體, 另一熟悉物體保持不變。記錄小鼠在測試期內(nèi)分別對新穎物體（TN）和原熟悉物體（TF）的探索時間, 識別能力同樣用相對辨別指數(shù)（DI）來表示。其反應的是動物的短時、非空間記憶能力。

④Morris水迷宮實驗

Morris水迷宮實驗是一種經(jīng)典的評價動物空間參考記憶能力的認知行為檢測方法。本實驗所采用的實時在線檢測系統(tǒng)由一個不銹鋼噴塑圓柱形水池和圖像采集分析系統(tǒng)兩部分組成。水池直徑為100 cm,高38 cm, 并且水溫維持在23 ± 2 °C。加入墨汁使之渾濁，水池被平均劃分為4個象限, 軟件記錄為1,2,3,4四個象限。一圓柱形平臺（直徑6 cm, 高15 cm）被置于低于水面1 cm 的其中一象限內(nèi), 上方安裝有攝像頭用于監(jiān)控動物游泳情況。

實驗分為定位航行階段（5 d）和空間探索階段(1 d)。首先開始為期5天的定航訓練, 開始前先將動物放在平臺上適應10 s, 然后隨機選取1個入水點, 將動物放入水中, 給予90 s 尋求平臺, 若成功找到平臺則讓其在平臺上停留10 s再歸籠, 若未找到平臺則引導動物至平臺, 停留10 s。每天每只動物訓練2次, 系統(tǒng)自動記錄動物找到平臺的時間（尋臺潛伏期）作為評價學習記憶能力的指標。于第6天,撤去平臺, 以目標象限的對角象限中點為入水點, 將動物面向池壁放入水中, 檢測 90 s, 記錄動物在目標象限的穿臺次數(shù)作為評價指標,用來檢測動物對平臺空間位置的準確記憶, 即記憶保持能力。

（2）氧化應激指標檢測

分別將小鼠的皮層和海馬組織與冷生理鹽水超聲混合（1: 9）, 然后將混勻液于3500 rpm（10 min, 4 °C）離心, 取上清液用于生化檢測。按照南京建成生物工程研究所的T-AOC, SOD, MDA和 GSH生化試劑盒說明書步驟分別檢測皮層和海馬內(nèi)的T-AOC, SOD活性和MDA和 GSH的含量。

（3）血清內(nèi)促炎因子檢測

血清內(nèi)促炎因子TNF-α, IL-6和IL-1β的含量測定按照ELISA試劑盒說明書進行。

3評價結(jié)果

（1）行為學結(jié)果：

①空場實驗

睡眠干擾對小鼠自主活動的影響注：A總路程(cm)；B平均速度(cm/s)。② 物體位置識別實驗 熟悉期結(jié)果如圖3（A）和（B）所示, 睡眠干擾14天未對小鼠的探索能力產(chǎn)生影響, 且各組小鼠對兩熟悉物體的探索時間亦未見差異, 表明所有動物對兩熟悉物體無偏愛性。在測試期,睡眠干擾14天后小鼠的物體位置識別能力明顯下降（P<0.05），表明小鼠的短時、空間學習記憶能力受損。

③ 新物體識別實驗

④Morris水迷宮實驗

在定位航行階段, 隨著訓練天數(shù)的增加,各組動物的尋臺潛伏期逐漸縮短, 而與對照組相比, 睡眠干擾模型組從第3天至第5天的潛伏期均顯著性增加（P<0.05）, 表明睡眠干擾14天能損害小鼠的空間學習記憶能力, 使得模型動物的認知功能受損。探索實驗結(jié)果（圖5B）表明, 睡眠干擾模型組的穿臺次數(shù)明顯減少（P<0.05），表明其對空間參考記憶亦有改善作用。

（2）氧化應激指標檢測

睡眠干擾14天后模型小鼠皮層和海馬內(nèi)的氧化應激水平顯著升高, 表現(xiàn)為T-AOC和SOD活性顯著性下降, 而MDA水平則明顯升高, 且GSH含量明顯減少（P<0.05,P<0.01 or P<0.001），結(jié)果表明睡眠干擾引起腦內(nèi)持續(xù)性氧化應激損傷可能是導致學習記憶能力下降的原因之一。

注：A皮層和海馬內(nèi)T-AOC活性；B皮層和海馬內(nèi)SOD活性；C皮層和海馬內(nèi)MDA水平；D皮層和海馬內(nèi)GSH含量。與對照組相比，#P<0.05， ##P<0.01，###P<0.001.

（3）炎性因子指標檢測

對血清內(nèi)促炎細胞因子（TNF-α, IL-6 and IL-1β）的含量進行測定, 結(jié)果如圖7所示, 模型組小鼠血清內(nèi)以上三種促炎細胞因子的含量均呈極顯著性增加（P<0.001），表明睡眠干擾激活小鼠機體內(nèi)的炎性反應，持續(xù)性炎性細胞因子釋放可能是誘發(fā)小鼠學習記憶水平下降的另一原因。

注：A TNF-α水平；B IL-6水平；C IL-1β水平。與對照組相比，###P<0.001.

1 動物：SPF級，ICR小鼠（4周齡；20±2g），雄性

2 儀器：滾筒式睡眠干擾儀(由中國航天員科研訓練中心、中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所和北京鑫海華儀科技有限公司聯(lián)合研制)

3實驗環(huán)境：隔音并且穩(wěn)定的SPF級動物房和睡眠干擾室環(huán)境（溫度：23-25℃，濕度：55%。12h/12h明暗周期）。動物購進后，在動物房適應7天后方可進行實驗。

4模型誘導方法：睡眠干擾采用滾筒式睡眠干擾儀裝置進行，造模方法如下：首先進行為期3天的睡眠干擾適應期，（1）將睡眠干擾儀一側(cè)滾筒壁打開，把特定水瓶裝滿動物飲用水后，與食物一起放入睡眠干擾儀食盒，再將睡眠干擾組小鼠放入儀器中，一組小鼠放入睡眠干擾儀的一個室，關(guān)閉打開的滾筒壁。（2）設(shè)置儀器參數(shù)，參數(shù)如下：轉(zhuǎn)速60s/圈，轉(zhuǎn)圈1圈，休息時間2m。設(shè)置完成后，選擇“開始”，按“ENT”鍵開始實驗。（3）每天適應3小時（8-11AM），適應時間到3小時，選擇“結(jié)束”，按“ENT”鍵停止實驗，打開滾筒壁取出動物，放回動物房，連續(xù)適應3天。隨后進行模型建立：將睡眠干擾組小鼠按上述步驟放入睡眠干擾儀，設(shè)置儀器參數(shù)，進行連續(xù)睡眠干擾14天。每天定期選擇“結(jié)束”，按“ENT”鍵停止實驗，打開滾筒壁，打開食盒加食加水，然后關(guān)閉食盒，關(guān)閉打開的滾筒壁，選擇“開始”，按“ENT”鍵開始實驗。睡眠干擾第14天開始進行認知行為學實驗檢測。檢測開始前，取出動物，放到相應的檢測室進行檢測，在行為學檢測時應盡量減少動物的非干擾時間，檢測完后及時放回滾筒內(nèi)繼續(xù)干擾。

圖1 滾筒式睡眠干擾儀圖（國家發(fā)明專利授權(quán)號：201210356645.X）

隨著現(xiàn)代社會發(fā)展，生活節(jié)奏加快、工作壓力大、生活方式不健康等因素導致很大一部分群體長期處于慢性睡眠干擾的狀態(tài)[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，睡眠障礙是當今世界一個應該得到重視和解決的公共衛(wèi)生現(xiàn)狀問題。目前睡眠障礙率達27%，而我國存在睡眠問題人口率則高達38.2%，甚至高于世界平均水平，即平均每四人中就有一人存在睡眠障礙問題。此外，航空、航天、航海等軍事特因環(huán)境下，由于晝夜生物節(jié)律顛倒，睡眠周期紊亂，睡眠不足或睡眠障礙，造成作業(yè)人員機體免疫力、作業(yè)能力、警覺性和判斷力降低，影響作業(yè)任務的完成，嚴重者危及生命。現(xiàn)代研究表明，睡眠是個體生存發(fā)育所必需的一項重要生理活動, 其對機體的能量平衡、免疫機能、學習的形成及維持記憶等起到關(guān)鍵作用[2, 3]，一旦睡眠障礙/干擾會引起情緒、認知功能以及免疫功能等一系列的改變, 伴隨疲勞的增加, 可引起生理、心理甚至行為的變化[4, 5]。睡眠干擾(Sleep Interruption，SI)是指由于環(huán)境或自身原因無法滿足正常睡眠的情況，一般指在24小時中的睡眠小于4小時。睡眠干擾可以分為部分睡眠干擾（partialsleep interruption, PSI）和完全睡眠干擾（total sleep interruption, TSI）。TSI指24h之內(nèi)完全無睡眠；PSI一般指24h之內(nèi)睡眠量通常達不到4h。研究已證實無論是部分睡眠干擾或是完全睡眠干擾均會對學習記憶功能產(chǎn)生損害[6]，此外睡眠干擾與諸如阿爾茨海默病、帕金森氏病、腦血管疾病等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病高度相關(guān)[7, 8]。針對睡眠干擾的諸多危害和缺乏有效對抗手段的現(xiàn)狀，臨床前研究選擇合適的動物模型模擬睡眠干擾產(chǎn)生的效應對于解釋睡眠干擾所致學習記憶障礙的分子機制并尋求特異防護手段意義重大。

目前睡眠干擾方法分為兩類：化學誘導法和物理因素干擾法。其中化學誘導法多采用對動物進行注射中樞興奮類化學藥物（如咖啡因、去氧麻黃堿、神經(jīng)毒素(DSP-4)、可樂定等）部分或全部剝奪睡眠，該類方法由于存在動物個體差異較大、不易掌握等問題而應用較少。物理因素誘導睡眠干擾方法主要包括小平臺水環(huán)境、滾筒、水平轉(zhuǎn)盤、跑臺、人工輕觸刺激等。由于小平臺水環(huán)境法因頻繁落水造成物溺水死亡率高、人工輕觸刺激需要消耗實驗人員的體力而較少應用。目前應用較多的滾筒、水平轉(zhuǎn)盤和跑臺等。本模型采用滾筒式對小鼠進行睡眠干擾建立穩(wěn)定的學習記憶障礙模型。

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