3.1.4 模型構建流程

利用CRISPR /Cas9 技術，建立CTLA4基因敲除小鼠模型，利用PCR、RT-PCR和Western Blot 的方法進行鑒定及分析。

3.1.5 CTLA4敲除小鼠的建立

3.1.5.1 CTLA4敲除小鼠模型的建立

（1）設計方案

一、載體構建

1.sgRNA 載體

載體名稱：pUC57-sgRNA expression vector

Addgene ID: 51132

根據(jù)基因信息選擇靶點，合成sgRNA（上海英濰捷基）

targeting site 1:

gggttcaaacacatctcaagg

m-ctla4-gRNA up1 5’TAGGgggttcaaacacatctca

m-ctla4-gRNA down1 5’aaacTGAGATGTGTTTGAACCC

targeting site 2:

gagacttctggaacatggaGg

m-ctla4-gRNA up2 5’TAGGgagacttctggaacatgg

m-ctla4-gRNA down2 5’aaacCCATGTTCCAGAAGTCTC

合成的sgRNA單鏈通過退火復性結合成小片段，插入BSAⅠ線性化的載體

sgRNA插入位點示意圖

圖1CTLA4敲除小鼠模型構建設計方案

構建完成的sgRNA載體通過體外轉錄成為可注射的sgRNA。（體外轉錄用試劑盒：Ambion Am1354）

2，CAS9 載體

載體名稱：pST1374-NLS-flag-linker-Cas9

Addgene ID: 44758

載體通過體外轉錄成為可注射的Cas9-RNA（體外轉錄用試劑盒：Ambion Am1345）

顯微注射：

1、超數(shù)排卵：15只3-4周齡c57雌鼠注射激素進行超排。

2、受精卵注射：取約150枚受精卵進行注射。

3、雄鼠結扎：制作30只8周齡輸精管結扎的c57雄鼠。

4、受體鼠制備：8-10周齡ICR雌鼠與結扎的ICR雄鼠交配后選取見栓的雌鼠。

5、胚胎移植：將注射后的受精卵移植到受體鼠輸卵管壺腹部（移植一次， 120枚卵，4只受體鼠）。

基因型鑒定：

1、剪尾編號：出生7-10天的乳鼠，剪取腳趾和尾尖進行編號及取材。

2、基因組DNA提取： 使用全式金（Transgen）公司的基因組DNA提取試劑盒（EE101-12）提取基因組DNA

3、PCR檢測：根據(jù)序列信息設計檢測引物（上海英濰捷基）

M-CTLA4-KO-S 5’AGAAATTATACTCTCCAAGACTCCACG

M-CTLA4-KO-A 5’CCTTAAGTCCCAGCTGAGATCC

KO：

TM=62℃WT：727bp ko:(見測序分析)

PCR反應體系及擴增程序（TaKaRa RR042A）

反應體系：

l10×LA PCRBufferⅡ(Mg2+ Plus)

l2.0 μl

ldNTP Mixture(2.5 μM)

l1.6 μl

l引物-S（50μM ）

l0.2 μl

l引物-A（50μM ）

l0.2 μl

l模板DNA

l2.0 μl

lLA Taq

l0.2 μl

l補加ddH2O至總體積

l20.0μl

擴增程序：

l95℃

l15 min；

l95℃, 30 s

lTM-2℃, 30 s

l72℃, 2 min 30循環(huán)；

l72℃

lmin；

6×loading buffer 終止反應。

用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳。

4、結果分析： 選取PCR檢測分子量不同于野生型條帶的 (下圖中箭頭所示)，將PCR產物進行TA克隆，之后用檢測引物進行菌液PCR，篩選有插入的克隆測序。

1-23#基因組PCR結果圖（TaKaRa marker DL2000）（上游PCR結果）

1-23#基因組PCR結果圖（TaKaRa marker DL2000）（KO PCR結果）

5、測序結果：

KO：4#，6#，7#，10#，15# 灰色為缺失部分

4#agaaattatactctccaagactccacgtctccaggtcctcagaggtgactcgaagcttcagtttcaagttgagtacattttccatccatggatttgcttgttttgttcagttttagtttgaatatttgaggtcgtctttacgacgtaacagctaaacccacggcttcctttctcgtaaaaccaaaacaaaaaggctctctgttcaggtgtcctgtgtgtgcactacacatatgtagcacgtaccttggatcaaagctgtctatataaagtccccgagtctgtgtgggttcaaacacatctcaaggcttctggatcctgttgggttttactctgctccctgaggacctcagcacatttgccccccagccatggcttgtcttggactccggaggtacaaagctcaactgcagctgccttctaggacttggccttttgtagccctgctcactcttcttttcatcccagtcttctctgaaggtgagtggagacttctggaacatggaggtggaggaggtgtttttcctacatgggtttcgttttttttttttctttcagaagctgaggacagtgatttatagaaatgccagaagttaaagccaaaccctctactttttggtttaacagcttcctacagacaagttccaagaagaatataggaggtctagcagtagcgaaggagctgagactagccacagcagcttgctgggatctcagctgggacttaagg

6#agaaattatactctccaagactccacgtctccaggtcctcagaggtgactcgaagcttcagtttcaagttgagtacattttccatccatggatttgcttgttttgttcagttttagtttgaatatttgaggtcgtctttacgacgtaacagctaaacccacggcttcctttctcgtaaaaccaaaacaaaaaggctctctgttcaggtgtcctgtgtgtgcactacacatatgtagcacgtaccttggatcaaagctgtctatataaagtccccgagtctgtgtgggttcaaacacatctcaaggcttctggatcctgttgggttttactctgctccctgaggacctcagcacatttgccccccagccatggcttgtcttggactccggaggtacaaagctcaactgcagctgccttctaggacttggccttttgtagccctgctcactcttcttttcatcccagtcttctctgaaggtgagtggagacttctggaacatggaggtggaggaggtgtttttcctacatgggtttcgttttttttttttctttcagaagctgaggacagtgatttatagaaatgccagaagttaaagccaaaccctctactttttggtttaacagcttcctacagacaagttccaagaagaatataggaggtctagcagtagcgaaggagctgagactagccacagcagcttgctgggatctcagctgggacttaagg

7#agaaattatactctccaagactccacgtctccaggtcctcagaggtgactcgaagcttcagtttcaagttgagtacattttccatccatggatttgcttgttttgttcagttttagtttgaatatttgaggtcgtctttacgacgtaacagctaaacccacggcttcctttctcgtaaaaccaaaacaaaaaggctctctgttcaggtgtcctgtgtgtgcactacacatatgtagcacgtaccttggatcaaagctgtctatataaagtccccgagtctgtgtgggttcaaacacatctcaaggcttctggatcctgttgggttttactctgctccctgaggacctcagcacatttgccccccagccatggcttgtcttggactccggaggtacaaagctcaactgcagctgccttctaggacttggccttttgtagccctgctcactcttcttttcatcccagtcttctctgaaggtgagtggagacttctggaacatggaggtggaggaggtgtttttcctacatgggtttcgttttttttttttctttcagaagctgaggacagtgatttatagaaatgccagaagttaaagccaaaccctctactttttggtttaacagcttcctacagacaagttccaagaagaatataggaggtctagcagtagcgaaggagctgagactagccacagcagcttgctgggatctcagctgggacttaagg

10#agaaattatactctccaagactccacgtctccaggtcctcagaggtgactcgaagcttcagtttcaagttgagtacattttccatccatggatttgcttgttttgttcagttttagtttgaatatttgaggtcgtctttacgacgtaacagctaaacccacggcttcctttctcgtaaaaccaaaacaaaaaggctctctgttcaggtgtcctgtgtgtgcactacacatatgtagcacgtaccttggatcaaagctgtctatataaagtccccgagtctgtgtgggttcaaacacatctcaaggcttctggatcctgttgggttttactctgctccctgaggacctcagcacatttgccccccagccatggcttgtcttggactccggaggtacaaagctcaactgcagctgccttctaggacttggccttttgtagccctgctcactcttcttttcatcccagtcttctctgaaggtgagtggagacttctggaacatggaggtggaggaggtgtttttcctacatgggtttcgttttttttttttctttcagaagctgaggacagtgatttatagaaatgccagaagttaaagccaaaccctctactttttggtttaacagcttcctacagacaagttccaagaagaatataggaggtctagcagtagcgaaggagctgagactagccacagcagcttgctgggatctcagctgggacttaagg

15#agaaattatactctccaagactccacgtctccaggtcctcagaggtgactcgaagcttcagtttcaagttgagtacattttccatccatggatttgcttgttttgttcagttttagtttgaatatttgaggtcgtctttacgacgtaacagctaaacccacggcttcctttctcgtaaaaccaaaacaaaaaggctctctgttcaggtgtcctgtgtgtgcactacacatatgtagcacgtaccttggatcaaagctgtctatataaagtccccgagtctgtgtgggttcaaacacatctcaaggcttctggatcctgttgggttttactctgctccctgaggacctcagcacatttgccccccagccatggcttgtcttggactccggaggtacaaagctcaactgcagctgccttctaggacttggccttttgtagccctgctcactcttcttttcatcccagtcttctctgaaggtgagtggagacttctggaacatggaggtggaggaggtgtttttcctacatgggtttcgttttttttttttctttcagaagctgaggacagtgatttatagaaatgccagaagttaaagccaaaccctctactttttggtttaacagcttcctacagacaagttccaagaagaatataggaggtctagcagtagcgaaggagctgagactagccacagcagcttgctgggatctcagctgggacttaagg

3.1.5.2 動物繁殖和表達圖譜分析

獲得F0代后，首先通過與野生型C57小鼠進行雜交，進行基因修飾小鼠傳代能力分析。之后CTLA4敲除小鼠通過雜合子與雜合子雜交，獲得CTLA4敲除小鼠純合子小鼠，進行蛋白表達分析，并用于后續(xù)實驗。

3.1.5.3 鼠尾基因組DNA鑒定

在幼崽出生后剪腳趾標記，并剪尾至1.5 mL EP管。然后參照鼠尾直接PCR試劑盒（bimake）說明書按以下程序操作。

1.1. 按小鼠數(shù)量配制組織消化液，試劑比例如下：

（單樣本）

Protease Plus

2 μL

Buffer L

100 μL

組織消化液現(xiàn)用現(xiàn)配，充分混勻后使用。

1.2. 向每個含有樣本的EP管中加入100 μL新鮮組織消化液，55℃水浴/金屬浴中消化15 min。組織消化時，務必將組織完全浸沒于消化液中。消化完成后，組織外觀上仍然完整，但足量的基因組DNA已經釋放，不影響后續(xù)的PCR實驗。

1.3. 將樣本置于95℃水浴/金屬浴中孵育5 min以滅活消化液中的蛋白酶活性。12000 rpm離心5分鐘，取上清作為PCR模板。消化后的上清或連同組織的消化液可于-20℃保存三個月。

2. PCR擴增

2.1. PCR反應體系：

PCR 反應組分

20 μL 反應體系 (μL)

50 μL 反應體系 (μL)

ddH2O

8

21

正向引物 (10 μM)

0.5

1

反向引物 (10 μM)

0.5

1

模板（消化產物）

1

2

2 x M-PCR OPTI? Mix

10

25

注：模板體積可以適當調整。

2.2. PCR反應條件：

溫度 (℃)

時間

循環(huán)數(shù)

94

5 min

1

94

20 sec

35

60

30 sec

72

X min (2kb/min)

72

5 min

1

12

--

1

3. 瓊脂糖凝膠電泳

試劑2 x M-PCR OPTITM Mix中含有溴酚藍染料，PCR產物可直接點樣進行瓊脂糖凝膠電泳。

1、造模因素信息

小鼠CTLA4基因位于第一號染色體的1C2區(qū)段（Chromosome 1: 60,887,000-60,915,832，ENSMUSG00000026011）

2、實驗動物背景信息

c57bl/6小鼠也被稱為c57 black 6，1921年被培育出來，屬于近交品系。該品系的最主要的兩個特點就是品系穩(wěn)定和易于繁殖。另外c57bl/6小鼠是第一個完成基因組測序的小鼠品系。

3、研究背景

細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4 (cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4，CTLA4)（CD152）和CD28是表達在CD4 +和CD8 + T細胞的同源受體，兩者共享在抗原呈遞細胞表面表達的一對配體，并且在T細胞活化中介導相反的功能。配體與CD28相互作用，介導T細胞與T細胞受體（TCR）信號共刺激。CTLA4最初被發(fā)現(xiàn)是一種傳遞抑制信號，對于終止免疫反應非常重要[1, 2]。T細胞活化受到CTLA4的負面調節(jié)，例如與CD28競爭與它們共同的配體B7.1和B7.2的結合[3]。盡管CTLA4調節(jié)免疫系統(tǒng)的確切機制仍存在爭議，但CTLA4的抑制功能受到廣泛認可[4]。所有CTLA4 敲除小鼠在淋巴結和脾臟均顯示大量淋巴細胞增殖，隨后白細胞對幾乎所有組織進行自身免疫攻擊，并導致小鼠過早死亡[1, 2, 5]。

[1]Waterhouse P, Penninger JM, Timms E, et al. Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice deficient in Ctla-4[J]. Science, 1995, 270(5238): 985-8.

[2]Tivol EA, Borriello F, Schweitzer AN, et al. Loss of CTLA-4 leads to massive lymphoproliferation and fatal multiorgan tissue destruction, revealing a critical negative regulatory role of CTLA-4[J]. Immunity, 1995, 3(5): 541-7.

[3]Sharpe AH, Freeman GJ. The B7-CD28 superfamily[J]. Nature reviews Immunology, 2002, 2(2): 116-26.

[4]Egen JG, Kuhns MS, Allison JP. CTLA-4: new insights into its biological function and use in tumor immunotherapy[J]. Nature immunology, 2002, 3(7): 611-8.

[5]Chambers CA, Sullivan TJ, Allison JP. Lymphoproliferation in CTLA-4-deficient mice is mediated by costimulation-dependent activation of CD4+ T cells[J]. Immunity, 1997, 7(6): 885-95.