為了研究Npsn在斑馬魚(yú)中性粒細(xì)胞中的功能，我們運(yùn)用CRISPER/Cas9技術(shù)對(duì)斑馬魚(yú)npsn進(jìn)行全基因組敲除，并且獲得了一系列npsn基因發(fā)生移碼突變的突變體斑馬魚(yú)，比如在exon5-Cas9靶點(diǎn)獲得的（-7，+0）（npsnsmu5）突變體，和在exon6-Cas9靶點(diǎn)處獲得的（-0，+1）（npsnsmu6）突變體，并且經(jīng)預(yù)測(cè)它們的蛋白結(jié)構(gòu)相對(duì)于野生型斑馬魚(yú)出現(xiàn)移碼突變和提前終止。但是我們通過(guò)WISH檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在npsnsmu5突變體斑馬魚(yú)中，npsn的信號(hào)幾乎是缺失的，并且qRT-PCR結(jié)果也同樣證明了在npsnsmu5突變體中npsn的mRNA水平下降到野生型斑馬魚(yú)的5%左右，可能是由npsn的無(wú)義突變導(dǎo)致了mRNA的全面降解所導(dǎo)致的。但是npsnsmu5純合突變體胚胎能夠正常存活到成年，大小和體型正常，并且是可以正常的產(chǎn)生后代。

為了研究Npsn缺陷是否影響斑馬魚(yú)中性粒細(xì)胞的發(fā)育，我們通過(guò)斑馬魚(yú)中性粒細(xì)胞特異性標(biāo)記基因mpx和lyz的整體原位雜交，發(fā)現(xiàn)npsnsmu5突變體和野生型斑馬對(duì)比，mpx+和lyz+信號(hào)點(diǎn)的數(shù)量沒(méi)有明顯差別。蘇丹黑染色也同樣發(fā)現(xiàn)SB+陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量也沒(méi)有差異。并且進(jìn)一步在DIC下觀察npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚(yú)中性粒細(xì)胞中的顆粒，也未發(fā)現(xiàn)明顯區(qū)別。以上結(jié)果表明，Npsn缺陷并不顯著影響斑馬魚(yú)中性粒細(xì)胞的發(fā)育和數(shù)量。這可能是因?yàn)镹psn只是斑馬魚(yú)中性粒細(xì)胞中的一種酶顆粒，缺失后并不影響中性粒細(xì)胞的發(fā)育，但是可能影響了中性粒細(xì)胞的某些功能。

為了研究Npsn缺陷對(duì)斑馬魚(yú)中性粒細(xì)胞功能的影響，而中性粒細(xì)胞的主要功能是參與機(jī)體的固有免疫反應(yīng)，因此我們做了斑馬魚(yú)大腸桿菌的侵染實(shí)驗(yàn)。我們利用顯微注射的方式感染npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚(yú)胚胎的卵黃囊，通過(guò)記錄并比較感染后兩者的生存率，發(fā)現(xiàn)npsnsmu5突變體在感染大腸桿菌后生存率相對(duì)于野生型胚胎顯著下降，體內(nèi)殘余的菌量明顯上升，并且在感染的早期階段，npsnsmu5突變體中炎性因子的表達(dá)水平比野生型明顯升高，這說(shuō)明了中性粒細(xì)胞在抵抗細(xì)菌感染中存在功能缺陷。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Npsn在中性粒細(xì)胞抵抗感染中的作用，我們通過(guò)構(gòu)建斑馬魚(yú)Npsn過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因系Tg(hsp:Myc-npsn)，并且同時(shí)感染大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)Npsn過(guò)表達(dá)后能顯著提高感染后斑馬魚(yú)的存活率。這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步表明，斑馬魚(yú)Npsn有助于斑馬魚(yú)抵抗細(xì)菌感染。

但是Npsn通過(guò)哪種方式來(lái)幫助中性粒細(xì)胞抵抗感染的呢？先前有體外實(shí)驗(yàn)證明，鯉魚(yú)的Npsn能夠水解纖連蛋白和明膠，而這兩種組分又是細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分，那么Npsn是否通過(guò)影響斑馬魚(yú)中性粒細(xì)胞的遷移來(lái)影響對(duì)大腸桿菌的抵抗的呢？為了驗(yàn)證這個(gè)觀點(diǎn)，我們觀察了在感染后4小時(shí)時(shí)傷口處中性粒細(xì)胞的數(shù)量，但是比較npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚(yú)并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯差異。另外，Npsn作為一種水解酶，它能否能夠直接水解和破壞大腸桿菌細(xì)胞的完整性，進(jìn)而影響大腸桿菌在機(jī)體內(nèi)存活的呢？并且Npsn缺陷主要影響斑馬魚(yú)清除哪種類(lèi)型的菌呢？為了驗(yàn)證這些問(wèn)題，我們也將npsnsmu5突變體斑馬魚(yú)和野生型斑馬魚(yú)同時(shí)感染了其他類(lèi)型的菌，如革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌銅綠假單胞菌等，發(fā)現(xiàn)Npsn缺陷后可能增加斑馬魚(yú)對(duì)革蘭氏陰性菌的敏感性。但是Npsn影響斑馬魚(yú)中性粒細(xì)胞抵抗細(xì)菌感染的具體機(jī)制，還需要更多的實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。另外npsnsmu5突變體可以作為斑馬魚(yú)免疫與炎癥反應(yīng)模型，對(duì)研究在感染過(guò)程中，中性粒細(xì)胞與病原菌的相互關(guān)系，以及對(duì)研發(fā)新的抗菌藥物具有重要的指導(dǎo)意義。

動(dòng)物模型的制備和應(yīng)用實(shí)驗(yàn)必須在具備相應(yīng)資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展。動(dòng)物模型的制備、應(yīng)用過(guò)程中的監(jiān)督管理、處置措施、對(duì)環(huán)境和生態(tài)影響等應(yīng)符合國(guó)家相關(guān)法律規(guī)定。

1．npsnsmu5突變體中中性粒細(xì)胞的數(shù)量沒(méi)有明顯改變

為了驗(yàn)證npsnsmu5突變體中npsn表達(dá)量的減少是由于每個(gè)中性粒細(xì)胞中npsn表達(dá)量下降，還是由于中性粒細(xì)胞的數(shù)量減少，我們利用斑馬魚(yú)整體原位雜交技術(shù)檢測(cè)中性粒細(xì)胞的其他標(biāo)記物mpx和lyz的表達(dá)是否發(fā)生改變。結(jié)果表明，在npsnsmu5 突變體內(nèi)lyz和mpx信號(hào)點(diǎn)并沒(méi)有明顯變化（如圖7 A, B, A’和B’所示），并且我們通過(guò)SB染色方法(主要染的中性粒細(xì)胞中脂質(zhì)顆粒)，發(fā)現(xiàn)SB信號(hào)點(diǎn)的數(shù)量也沒(méi)有明顯變化（如圖7 C和C’所示）。在微分干涉顯微鏡（differential interference contrast microscope，DIC)下觀察中性粒細(xì)胞的顆粒，同樣沒(méi)有發(fā)現(xiàn)npsnsmu5 突變體與野生型斑馬魚(yú)有明顯的改變。以上結(jié)果表明，npsnsmu5突變體中中性粒細(xì)胞的數(shù)量沒(méi)有明顯改變。

圖7. npsnsmu5突變體中中性粒細(xì)胞的數(shù)量沒(méi)有明顯改變。

（A和A’）.lyz整體原位雜交和PBI區(qū)lyz+細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)。（B和B’）.mpx整體原位雜交和PBI區(qū)mpx+細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)。（C和C’）.SB染色和SB+信號(hào)點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)。

2．npsn缺陷導(dǎo)致斑馬魚(yú)抵抗E.coli感染的能力下降。

中性粒細(xì)胞在抵抗細(xì)菌感染中起著不可或缺的作用。為了檢測(cè)斑馬魚(yú)在敲除npsn后是否影響斑馬魚(yú)抵抗細(xì)菌感染的能力。我們分別在野生型斑馬魚(yú)組和npsnsmu5突變體組分別在卵黃囊處感染大腸桿菌。為了摸索一個(gè)合適的大腸桿菌感染濃度，我們分別在野生型斑馬魚(yú)組打入10、100和1000 CFUs的菌落，發(fā)現(xiàn)10 CFUs菌就可以導(dǎo)致斑馬魚(yú)的感染死亡，并且隨著感染大腸桿菌菌量的增加，斑馬魚(yú)的死亡率逐漸升高，并且感染10和100 CFUs大腸桿菌時(shí)從2 dpi開(kāi)始死亡，而感染1000 CFUs大腸桿菌時(shí)，第一天就會(huì)出現(xiàn)死亡（如圖8 A所示）。由于100 CFUs的大腸桿菌菌量能夠使野生型斑馬魚(yú)的存活率在40 %-60 %之間，因此100 CFUs的大腸桿菌菌量作為本研究所使用的感染菌量。當(dāng)野生型斑馬魚(yú)和npsnsmu5突變體同時(shí)感染大腸桿菌后，在1 dpi所有的胚胎都正常存活，在2 - 3 dpi魚(yú)體開(kāi)始出現(xiàn)死亡，并且npsnsmu5突變體的存活率比野生型對(duì)照組顯著下降，在4 - 5 dpi時(shí)，有些胚胎存活下來(lái)，同時(shí)也沒(méi)有出現(xiàn)明顯感染的表型，這說(shuō)明大腸桿菌在這些胚胎內(nèi)的生長(zhǎng)成功被抑制（如圖8 B所示）。以上結(jié)果表明，npsn缺陷導(dǎo)致斑馬魚(yú)抵抗E.coli感染的能力下降。

圖8. npsn缺陷降低斑馬魚(yú)抵抗大腸桿菌感染。

A.野生型斑馬魚(yú)感染不同濃度的大腸桿菌后的生存曲線。B.野生型斑馬魚(yú)和npsnsmu5突變體斑馬魚(yú)

為了進(jìn)一步確定Npsn在斑馬魚(yú)抵抗大腸桿菌感染中的作用，我們?cè)趎psn mRNA的起始轉(zhuǎn)錄點(diǎn)ATG附近設(shè)計(jì)了嗎啉代（morpholino）片段（npsn-ATG-morpholino），嗎啉代是一種被修飾過(guò)的可以抵抗核酸酶消化的反義寡核苷酸[88]，能夠行使干擾基因功能或者阻斷RNA翻譯的起始或者阻礙RNA的剪切。為了驗(yàn)證npsn-ATG-morpholino是否可以干擾npsn基因翻譯的起始，我們首先體外合成了npsn-ATG-morpholino互補(bǔ)片段（complementation）（DNA模板片段如圖9 A所示），后面連接EGFP的序列的RNA片段，然后和npsn-ATG-morpholino一起通過(guò)顯微注射技術(shù)注射到斑馬魚(yú)單細(xì)胞的胚胎中，在熒光顯微鏡下觀察是否有綠色熒光出現(xiàn)。結(jié)果顯示，在注射npsn-ATG-morpholino(complementation)-EGFP的RNA序列的對(duì)照組，可以觀察到綠色熒光的表達(dá)，而注射npsn-ATG-morpholino(complementation)-EGFP和npsn-ATG-morpholino混合物組未出現(xiàn)綠色熒光的表達(dá)（如圖9 B所示），說(shuō)明npsn-ATG-morpholino序列可以有效阻止npsn轉(zhuǎn)錄的起始。然后我們注射該morpholino片段和野生型斑馬魚(yú)同時(shí)感染大腸桿菌，結(jié)果顯示，相對(duì)于野生型斑馬魚(yú)，注射npsn-ATG-morpholino組斑馬魚(yú)的存活率顯著下降，這說(shuō)明敲低斑馬魚(yú)npsn的表達(dá)，使斑馬魚(yú)抵抗大腸桿菌感染的能力下降（如圖9 C所示）,這與npsnsmu5突變體在感染大腸桿菌后的表型相似。以上結(jié)果進(jìn)一步證明，斑馬魚(yú)npsn缺陷能夠?qū)е掳唏R魚(yú)抵抗大腸桿菌感染的能力下降。

圖9. 敲低npsn的表達(dá)使斑馬魚(yú)抵抗大腸桿菌的能力下降。

A.用于體外轉(zhuǎn)錄npsn-ATG-morpholino(complementation)-EGFPRNA的DNA片段的模式圖；B. npsn-ATG-morpholino的效率檢測(cè)；C. 野生型斑馬魚(yú)和注射npsn-ATG-morpholino斑馬魚(yú)同時(shí)感染大腸桿菌后的生存曲線。log-rank test，*** p＜0.001，n＞60。

3．npsn缺陷導(dǎo)致斑馬魚(yú)感染后體內(nèi)殘余大腸桿菌量增加

我們檢測(cè)了大腸桿菌菌群在npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚(yú)體內(nèi)增殖的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)在感染大腸桿菌后兩天，在npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚(yú)中大腸桿菌的數(shù)量都有所上升，并且在大腸桿菌在npsnsmu5突變體中增殖的速度比較快，導(dǎo)致在1 dpi（days post infection）和2 dpi，npsnsmu5突變體斑馬魚(yú)體內(nèi)殘留更多的大腸桿菌（如圖10所示）。這說(shuō)明npsn缺陷影響了斑馬魚(yú)中性粒細(xì)胞有效控制大腸桿菌感染的能力，使大腸桿菌在體內(nèi)繁殖的更快，進(jìn)而引發(fā)了更嚴(yán)重的感染。

圖10. npsn缺陷導(dǎo)致斑馬魚(yú)感染后體內(nèi)殘余大腸桿菌量增加。

4．npsn缺陷導(dǎo)致斑馬魚(yú)感染大腸桿菌后早期炎性因子水平顯著升高。

體內(nèi)炎癥因子水平是判斷體內(nèi)炎癥反應(yīng)的重要指標(biāo)之一，因此我們利用qRT-PCR技術(shù)，檢測(cè)了在大腸桿菌感染早期相關(guān)炎性因子和趨化因子的表達(dá)水平。il-1β（interleukin-1 beta, IL-1β）、tnf-α（Tumor Necrosis Factor a）和tnf-β（Tumor Necrosis Factor β）是重要的炎性因子，正常情況下在體內(nèi)的表達(dá)量很低，在機(jī)體遭受到感染時(shí)，其表達(dá)量迅速上升。我們發(fā)現(xiàn)在早期感染中，il-1b、 tnf-a和tnf-β表達(dá)都顯著上升，并且npsnsmu5突變體中的表達(dá)水平比野生型斑馬魚(yú)顯著升高。il-8（interleukin-8, IL-8）是相對(duì)下游基因，并且對(duì)中性粒細(xì)胞的募集起著重要的作用。我們發(fā)現(xiàn)，il-8的表達(dá)量與il-1b、tnf-a和tnf-β表達(dá)趨勢(shì)一致，在npsnsmu5突變體中的表達(dá)量也比野生型對(duì)照組中顯著升高（如圖11所示）。以上結(jié)果表明，斑馬魚(yú)npsn缺陷可以導(dǎo)致斑馬魚(yú)體內(nèi)的炎癥反應(yīng)更為強(qiáng)烈。

圖11. npsnsmu5突變體在感染大腸桿菌早期炎癥反應(yīng)更為強(qiáng)烈。

5. npsn的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了針對(duì)大腸桿菌感染的宿主免疫反應(yīng)

為了評(píng)估Npsn是否增強(qiáng)了E.coli的清除，我們將融合了6Myc標(biāo)簽并由hsp啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Npsn編碼序列克隆到Tol2載體中（稱(chēng)為作為pTol2-hsp-Myc-npsn）。將該構(gòu)建體注射到單細(xì)胞階段的WT胚胎中，并通過(guò)抗Myc染色鑒定F0的后代。選擇F1Myct胚胎，并標(biāo)記為T(mén)g（hsp：Myc-npsn）品系。隨后將Tg（hsp：Myc-npsn）和WT胚胎感染大腸桿菌，并置于熱激條件下，然后記錄存活率。我們的發(fā)現(xiàn)表明，相對(duì)于WT變體，Tg（hsp：Mycnpsn）系表現(xiàn)出明顯更高的存活率（圖12），這表明npsn的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了斑馬魚(yú)胚胎中宿主對(duì)大腸桿菌感染的免疫反應(yīng)。

圖12. 注射100 CFU的大腸桿菌后，Tg(hsp：Myc-npsn)和WT胚胎的存活曲線。

當(dāng)我們測(cè)量與感染的胚胎的體內(nèi)細(xì)菌生長(zhǎng)相關(guān)的動(dòng)力學(xué)曲線時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)在1和2 dpi時(shí)，Tg(hsp：Myc-npsn)胚胎中的細(xì)菌負(fù)荷顯著低于野生型胚胎。數(shù)據(jù)顯示，大腸桿菌在npsn過(guò)表達(dá)的胚胎中增殖較慢，這表明npsn過(guò)表達(dá)可以增強(qiáng)宿主抵抗斑馬魚(yú)胚胎中大腸桿菌感染的防御能力.在Tg(hsp：Myc-npsn)胚胎中，炎癥因子（tnfa，il-8和il-1b）的表達(dá)低于野生型對(duì)照（圖13f），表明npsn過(guò)表達(dá)的胚胎中炎癥的減輕。此外，過(guò)表達(dá)npsn可以挽救npsnsmu5突變體胚胎中改變的炎癥反應(yīng)（圖13g），這表明Npsn在宿主抵抗細(xì)菌的防御中很重要。

圖13. 炎癥因子（tnfa，il-8和il-1b）的表達(dá)

f. 2 hpi時(shí)Tg(hsp:Mycnpsn)胚胎中炎癥反應(yīng)的變化。g. npsn過(guò)表達(dá)可挽救炎性細(xì)胞因子表達(dá)的改變

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：野生型AB品系斑馬魚(yú)，養(yǎng)殖溫度為28.5℃。

1.斑馬魚(yú)npsn的基因信息以及Cas9靶位點(diǎn)的確立

根據(jù)Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)信息，npsn位于斑馬魚(yú)第7號(hào)染色體上，含有4個(gè)轉(zhuǎn)錄本，其中3個(gè)轉(zhuǎn)錄本npsn-001、-002和-003可以編碼蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)錄本npsn-004不可以編碼蛋白。我們通過(guò)對(duì)各個(gè)編碼蛋白轉(zhuǎn)錄本的cDNA序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)三個(gè)轉(zhuǎn)錄本的編碼序列（coding sequence，CDS）大體相同，起始密碼子的位置都位于外顯子2上，由于剪切方式的不同產(chǎn)生了不同的終止子（如圖2所示）。

根據(jù)npsn各轉(zhuǎn)錄本編碼蛋白的共有序列以及Npsn蛋白的功能域預(yù)測(cè)，我們?cè)趎psn基因外顯子5和外顯子6上選取npsn-Cas9的靶位點(diǎn)（如圖2所示）。其中在npsn-exon5上選取的Cas9靶位點(diǎn)序列為5’-GGAGACATCGCCTTTCCCAG-3’，在npsn-exon6上選取的Cas9靶位點(diǎn)序列為5’-GGTCAGGTCGTGTCTCTCCAG-3’。

2. 用于CRISPER/Cas9敲除實(shí)驗(yàn)斑馬魚(yú)的準(zhǔn)備及靶位點(diǎn)SNP的檢測(cè)

首先挑選20對(duì)3 - 5月齡體型正常的AB野生型斑馬魚(yú)，并且每個(gè)Cas9靶位點(diǎn)預(yù)準(zhǔn)備10對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行Cas9靶位點(diǎn)處是否存在SNP的檢測(cè)。我們首先在每個(gè)Cas9靶位點(diǎn)附近設(shè)計(jì)PCR引物，

其中在npsn-exon5-Cas9處設(shè)計(jì)引物序列為：

F: 5’-GGACAGTGCTATTGCGTTTGG-3’，

R: 5’-GCCTTGTTCAATCACTGCTACTTC-3’，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為435 bp；

在npsn-exon6-Cas9處引物序列為：

F: 5’-TGCATTTTCTGTCATTTTCCTGTG-3’，

R: 5’-TGTTCTGATAGAGGATCCGGATG-3’，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為267 bp。

用眼科剪剪取少量斑馬魚(yú)尾鰭組織，先加入20 uL堿液（25 mM NaOH+ 200μM的EDTA（~ PH 12）），將樣品置于95 ℃水浴鍋中裂解30分鐘，在振蕩器上震碎組織，然后加入等體積的中和液40 mM的中和液（TRIS-HCL(~ PH 5)），離心，取上清液作為PCR反應(yīng)中的DNA模板。PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件如下：

PCR反應(yīng)結(jié)束后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的大小是否正確以及條帶是否特異。若PCR產(chǎn)物大小正確，并且條帶特異，可以將PCR產(chǎn)物送去公司進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，將PCR產(chǎn)物中有SNP的斑馬魚(yú)舍棄，留下無(wú)SNP的親本進(jìn)行下步npsn-Cas9敲除實(shí)驗(yàn)。同時(shí)送公司合成用于gRNA的制備的長(zhǎng)片段引物FP（oligo），

其中npsn-exon5 oligo的序列為：

5’-TAATACGACTCACTATAggagacatcgcctttcccagGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’（T7啟動(dòng)子序列 + Cas9靶位點(diǎn)序列 + gRNA - FP）；

npsn-exon6 oligo的序列為：

5’- TAATACGACTCACTATAggtcaggtcgtgtctctccagGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’。

3. Cas9 mRNA以及gRNA的制備

3.1 Cas9 mRNA的合成

1）pSP6-2sNLS-spCas9 載體的線性化：

10X CutSmart? Buffer：5 uL

Xba I： 1 uL

DNA (pSP6-2sNLS-spCas9)： 2 ug

ddH2O： up to 50 uL

37 ℃孵育4小時(shí)，取少量酶切產(chǎn)物電泳確定是否線性化完全，然后直接回收線性化產(chǎn)物。

2）體外轉(zhuǎn)錄合成Cas9 mRNA：

按照SP6體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（Ambion，AM1340）的說(shuō)明進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，利用微量分光光度計(jì)檢測(cè)合成的Cas9 mRNA的濃度，然后將mRNA稀釋成600 ng/uL，并且分裝后于- 80 ℃冰箱長(zhǎng)期保存。

3.2 gRNA的制備

1）gRNA DNA模板的制備：

取5 uL PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA瓊脂糖凝膠電泳來(lái)分析目的條帶是否單一，并且將PCR產(chǎn)物純化回收，用微量分光光度計(jì)分析回收產(chǎn)物的濃度，此DNA片段作為下步gRNA體外轉(zhuǎn)錄的模板。

2）gRNA的體外轉(zhuǎn)錄合成：

表1-2-3. 體外轉(zhuǎn)錄體系

Tab.1-2-3 in vitro transcription system

反應(yīng)體系混勻后，置于37 ℃孵育4 - 5小時(shí)。加入2 uL DNase I消化去除DNA模板，并且取1 uL反應(yīng)液進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)模板DNA是否消化完全，以及大體估測(cè)產(chǎn)物gRNA的濃度。

3）gRNA的純化：

轉(zhuǎn)錄體系（20 uL）每管加500 uL TRIzol 試劑，震蕩混勻；

加100 uL三氯甲烷，手動(dòng)搖晃15 s，常溫靜置3 min；

12000 X g，4度，離心15分鐘，取上清于新的EP管中；

加入等體積的異丙醇溶液，震蕩混勻，靜置10 min；

12000 X g，4度，離心10分鐘，去上清液，留沉淀；

向沉淀中加入1 mL的75 %的乙醇(溶于DEPC處理過(guò)的H2O)，震蕩混勻；

12000 X g，4度，離心5分鐘，去上清液，留沉淀；

待乙醇揮發(fā)干凈，加入5 uL的DEPC處理過(guò)的H2O；

用微量分光光度計(jì)測(cè)RNA的濃度，瓊脂糖凝膠電泳，以及稀釋成不同濃度的RNA用于顯微注射，剩余RNA儲(chǔ)液置于- 80 ℃冰箱內(nèi)長(zhǎng)期保存。

3.3顯微注射

將Cas9mRNA（300 ng/ul）和gRNA（不同濃度梯度）按照體積比1 : 1混合，通過(guò)顯微注射方式注射入單細(xì)胞時(shí)期（出生后半小時(shí)內(nèi)）的斑馬魚(yú)魚(yú)卵中，液滴體積大小大約為0.5 nL。顯微注射后，更換新鮮的胚胎培養(yǎng)液。并且待胚胎發(fā)育至原腸胚時(shí)期，用吸管吸走死亡的胚胎，將存活的胚胎再次更換新鮮的胚胎培養(yǎng)液。

3.4 Cas9靶位點(diǎn)效率的檢測(cè)

采用T7 核酸內(nèi)切酶 I酶切法檢測(cè)Cas9靶位點(diǎn)的效率，T7 核酸內(nèi)切酶 I 可以識(shí)別并切割不完全配對(duì) DNA、十字型結(jié)構(gòu) DNA、Holliday 結(jié)構(gòu)或交叉 DNA、異源雙鏈DNA 或者以更慢的速度切割或切刻雙鏈 DNA，因此常用于突變體的檢測(cè)。具體如下：

取20顆大約24 hpf的小魚(yú)胚胎分別放置于96孔PCR板中，并且取4顆AB野生型胚胎作為對(duì)照組。吸干胚胎培養(yǎng)液，每孔加入20 uL的組織裂解液，樣品置于95 ℃水浴鍋內(nèi)裂解30分鐘，在振蕩器上震碎組織，然后加入等體積的中和液，離心，取上清液作為PCR模板。PCR反應(yīng)條件如下：

擴(kuò)增PCR產(chǎn)物利用DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物的特異性，將剩余的PCR產(chǎn)物置于98 ℃水浴鍋中水浴10分鐘（充分打開(kāi)DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)），使其緩慢將至室溫，然后進(jìn)行T7 核酸內(nèi)切酶 I酶切反應(yīng)，酶切體系如下：

10 X NEB Buffer 2.1： 1 uL

PCR 產(chǎn)物： 4uL

T7E1酶:0.2 uL

ddH2O：up to 10 uL

37 ℃孵育2小時(shí)，電泳，確定條帶是否被切開(kāi)，其中前20孔樣品是打了Cas9的實(shí)驗(yàn)組，后四個(gè)樣品為AB對(duì)照組。

npsn-exon5-Cas9的PCR產(chǎn)物大小為435 bp，對(duì)照組未被切開(kāi)，進(jìn)一步說(shuō)明了在此片段中不存在SNP，而實(shí)驗(yàn)組有部分DNA被切成220 bp左右的片段，這說(shuō)明Cas9 mRNA在靶點(diǎn)處進(jìn)行了切割，并且產(chǎn)生了突變，并且根據(jù)DNA電泳條帶的亮度估測(cè)此位點(diǎn)的突變效率大約70 %（如圖3所示）。

npsn-exon6-Cas9的PCR產(chǎn)物大小為267 bp，對(duì)照組未被切開(kāi)，進(jìn)一步說(shuō)明了在此片段中不存在SNP，而實(shí)驗(yàn)組有部分DNA被切成150 bp和120 bp的DNA片段，這說(shuō)明Cas9 mRNA在靶點(diǎn)處進(jìn)行了切割，并且產(chǎn)生了突變，并且根據(jù)DNA電泳條帶的亮度估測(cè)此位點(diǎn)的突變效率大約50 %（如圖4所示）。

圖3. npsn-exon5-cas9靶位點(diǎn)效率檢測(cè)結(jié)果

圖4. npsn-exon6-cas9靶位點(diǎn)效率檢測(cè)結(jié)果

4. 斑馬魚(yú)組織DNA的粗提。

1）將50 X的組織裂解液稀釋成1 X的工作液（吸取200 uL 50 X組織裂解液，加入去離子水稀釋到10 mL溶液）；將50 X的中和液稀釋成1 X的工作液（吸取200 uL 50 X中和液，加入去離子水稀釋到10 mL溶液）

2）用吸管吸取斑馬魚(yú)胚胎于EP管中，并且用小量程的槍小心吸走多余液體，加入20 uL組織裂解液；

3）將EP管放入95 ℃水浴鍋內(nèi)裂解30分鐘；

4）震蕩EP管，使組織充分裂解；

5）向EP管中加入相同體積的中和液，震蕩混勻并且離心；

6）吸取上清液即可作為PCR反應(yīng)的模板。

5．npsn缺陷斑馬魚(yú)模型構(gòu)建結(jié)果檢測(cè)

我們?cè)O(shè)計(jì)Cas9靶點(diǎn)在npsn的exon5和exon6上，其中npsn-exon5-Cas9靶點(diǎn)獲得（-7，+0）突變體（稱(chēng)為npsnsmu5）（如圖5 A所示），在npsn-exon6-Cas9靶點(diǎn)獲得（-0，+1）突變體（稱(chēng)為npsnsmu6）（如圖5 B所示）。npsnsmu5和npsnsmu6的純合突變體形態(tài)正常，能夠存活至成年，并且正常的進(jìn)行繁殖。

6．突變體中npsn mRNA表達(dá)變化檢測(cè)

為了檢測(cè)突變體中npsn mRNA的表達(dá)是否發(fā)生改變，我們利用npsn的整體原位雜交技術(shù)檢測(cè)npsnsmu5突變體中npsn mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示，在npsnsmu5突變體中，npsn信號(hào)點(diǎn)幾乎檢測(cè)不到（如圖6 A所示），在npsnsmu6突變體中同樣出現(xiàn)npsn信號(hào)點(diǎn)的缺失。為了檢測(cè)npsnsmu5突變體中npsn是發(fā)生了部分降解還是全面降解，我們?cè)谕蛔兾稽c(diǎn)的前面、后面以及包含突變點(diǎn)處分別設(shè)計(jì)qPCR的引物，經(jīng)qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，npsnsmu5中npsn的表達(dá)都下降到原來(lái)的5 %左右（如圖6 B所示），這說(shuō)明npsnsmu5突變體中npsn mRNA發(fā)生了全面降解，這種降解可能是由于無(wú)義突變介導(dǎo)mRNA降解（nonsense-mediated decay, NMD）引起的。

圖6. npsnsmu5突變體中npsn mRNA發(fā)生降解。

A. 3 dpf npsnsmu5突變體和同胞的npsn整體原位雜交。B. qRT-PCR檢測(cè)npsnsmu5突變體和同胞中npsn表達(dá)量的變化。

1．中性粒細(xì)胞的形態(tài)及生化特征

原始中性粒細(xì)胞的發(fā)育首先由髓系祖細(xì)胞經(jīng)譜系決定，發(fā)育成粒細(xì)胞前體細(xì)胞，再由粒細(xì)胞前體細(xì)胞經(jīng)過(guò)增殖，分化和成熟形成有功能的中性粒細(xì)胞。在斑馬魚(yú)中，區(qū)分中性粒細(xì)胞可通過(guò)以下形態(tài)學(xué)與細(xì)胞學(xué)方法[1,2]：（1）成熟的中性粒細(xì)胞最顯著的形態(tài)學(xué)特征為含有分葉核以及大量顆粒的細(xì)胞質(zhì)，可以在循環(huán)系統(tǒng)以及結(jié)締組織中被很清晰地辨認(rèn)。（2）還可以通過(guò)分子標(biāo)記來(lái)分辨不同成熟時(shí)期的中性粒細(xì)胞。已經(jīng)有研究報(bào)道的粒細(xì)胞特異分子標(biāo)記有轉(zhuǎn)錄因子C/ebp1，粒細(xì)胞顆粒中含有的髓過(guò)氧化物酶（Mpx）、溶菌酶C（Lyz）等。（3）另外，還可通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞的激活、趨化、變形運(yùn)動(dòng)能力、及吞噬、殺菌作用來(lái)辨別。（4）此外中性粒細(xì)胞可被蘇丹黑B（Sudanblack B，SB）特異性染色，并且可根據(jù)染色程度來(lái)辨別不同分化過(guò)程的中性粒細(xì)胞。

2．中性粒細(xì)胞與病原菌感染

中性粒細(xì)胞是一種具有多形核的白細(xì)胞，是人體固有免疫中的重要組成成分，在機(jī)體抵抗病原菌感染時(shí)起著重要的作用。中性粒細(xì)胞在體內(nèi)含量豐富，大約占人體白細(xì)胞總數(shù)的40%-75%[3]，并且在機(jī)體遭受病原菌感染時(shí)，中性粒細(xì)胞能夠迅速的從血管中遷移到感染部位[4]。當(dāng)中性粒細(xì)胞到達(dá)感染處后，主要通過(guò)兩種方式來(lái)抵抗感染，一種是分泌大量的細(xì)胞因子和趨化因子，比如IL-1b[5], IL-18[6], LL-37[7] ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA 等，這些小分子能夠招募和激活更多的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞到達(dá)感染部位，共同抵抗感染。另一方面，中性粒細(xì)胞還能夠直接吞噬和消化病原菌，這主要依賴(lài)于斑馬魚(yú)中性粒細(xì)胞中含有豐富的顆粒酶。中性粒細(xì)胞內(nèi)含有多種顆粒，這些顆粒富含各種殺菌作用的蛋白，并且在終末分化完成之前各種富含不同組分的顆粒必須組裝完成（如圖1所示）。中性粒細(xì)胞中三種顆粒分別是（1）嗜天青顆粒：又稱(chēng)初級(jí)顆粒，在早幼粒細(xì)胞中數(shù)量最多，顆粒中含有髓過(guò)氧化物酶、溶菌酶及較多的水解酶。（2）特異顆粒：又稱(chēng)次級(jí)顆粒，其中含有乳鐵蛋白、溶菌酶等，顆粒膜上有多種CD抗原和受體。（3）白明膠酶顆粒：含白明膠酶、溶菌酶[8]。這些顆粒主要通過(guò)兩種方式來(lái)殺滅病原菌。一種是氧依賴(lài)性殺菌途徑，主要通過(guò)激活膜結(jié)合成分NADPH系統(tǒng)，產(chǎn)生大量的活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）來(lái)直接氧化并殺死病原菌[9]；另一種方式是通過(guò)氧非依賴(lài)性方式來(lái)消化破壞病原菌的細(xì)胞膜或壁結(jié)構(gòu)的完整性[10,11]，從而通過(guò)使病原菌失去滲透壓而死亡。但是目前對(duì)這些顆粒酶的研究大多數(shù)是在體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的，大部分顆粒酶的體內(nèi)功能是未知的。因此了解和研究這些顆粒酶的成分以及顆粒酶的功能有助于研發(fā)新的抗菌酶。

圖1. 中性粒細(xì)胞中所含的顆粒酶種類(lèi)，引用自Borregaard 等[12]。

3．斑馬魚(yú)Npsn蛋白的簡(jiǎn)介

Npsn最早在鯉魚(yú)（Cyprinus carpio）的淋系造血組織中發(fā)現(xiàn)，屬于蝦紅素蛋白家族（astacinfamily）的一員，并且具有肽鏈內(nèi)切酶活性[13]。蝦紅素蛋白家族屬于金屬鋅蛋白酶超家族的一員，在蛋白質(zhì)消化、個(gè)體背腹軸確定以及形態(tài)發(fā)生中起著重要的作用[14]。研究者通過(guò)對(duì)比鯉魚(yú)的Npsn的蛋白序列與其他物種的同蛋白家族酶的相似性，發(fā)現(xiàn)Npsn與medaka的孵化酶有大于50%的序列相似性，但是作者并沒(méi)有在鯉魚(yú)的孵化液中檢測(cè)到Npsn的存在，所以作者猜測(cè)Npsn可能沒(méi)有孵化酶的活性。而關(guān)于Npsn的另一個(gè)研究是在斑馬魚(yú)中進(jìn)行的，作者通過(guò)分析斑馬魚(yú)造血組織的ESTs序列以及整體原位雜交（Whole-mount In Situ Hybridization, WISH）實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了三個(gè)新的特異性表達(dá)在斑馬魚(yú)血管以及造血組織中的基因，Npsn就是其中的一個(gè)[15]。并且作者通過(guò)雙色原位雜交進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Npsn可能表達(dá)在斑馬魚(yú)的中性粒細(xì)胞中。根據(jù)以上前人的研究，我們猜測(cè)，Npsn可能是斑馬魚(yú)中性粒細(xì)胞中的一種顆粒酶，然而 Npsn在中性粒細(xì)胞中的作用，以及是否參與到宿主先天免疫至今尚未有研究。

4．斑馬魚(yú)在作為研究中性粒細(xì)胞顆粒酶功能的模式生物中的優(yōu)越性

近幾十年來(lái)，斑馬魚(yú)逐漸成為一種強(qiáng)大的工具來(lái)研究感染類(lèi)疾病，除了斑馬魚(yú)的傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)外，在研究中性粒細(xì)胞和病原菌的相互關(guān)系中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。首先，斑馬魚(yú)中性粒細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程是保守的，都是起源于造血干細(xì)胞，通過(guò)早幼粒、中幼粒最終發(fā)育成為成熟的帶有分頁(yè)核的粒細(xì)胞[12]。其次，斑馬魚(yú)中成熟的轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以用熒光蛋白標(biāo)記中性粒細(xì)胞，進(jìn)而在活體實(shí)時(shí)觀察中性粒細(xì)胞對(duì)病原菌的響應(yīng)以及吞噬病原菌的過(guò)程[16]。第三，利用微分干涉相差顯微鏡顯微鏡（DIC）可以清晰看到中性粒細(xì)胞所含的顆粒酶，以及顆粒酶的發(fā)育過(guò)程。

參考文獻(xiàn)

[1] Le Guyader D,Redd MJ, Colucci-Guyon E, et al. Origins and unconventional behavior ofneutrophils in developing zebrafish[J]. Blood, 2008,111(1):132-41.

[2] Jin H, Li L, Xu J,et al. Runx1 regulates embryonic myeloid fate choice in zebrafish through anegative feedback loop inhibiting Pu.1 expression[J]. Blood,2012,119(22):5239-49.

[3] Witko-Sarsat V,Rieu P, Descamps-Latscha B, et al. Neutrophils: molecules, functions andpathophysiological aspects[J]. Lab Invest, 2000,80(5):617-53.

[4] Amulic B, CazaletC, Hayes GL, et al. Neutrophil function: from mechanisms to disease[J]. AnnuRev Immunol, 2012,30:459-89.

[5] Dinarello CA.Biologic basis for interleukin-1 in disease[J]. Blood, 1996,87(6):2095-147.

[6] Wawrocki S,Druszczynska M, Kowalewicz-Kulbat M, et al. Interleukin 18 (IL-18) as a targetfor immune intervention[J]. Acta Biochim Pol, 2016,63(1):59-63.

[7] Stephan A,Batinica M, Steiger J, et al. LL37:DNA complexes provide antimicrobial activityagainst intracellular bacteria in human macrophages[J]. Immunology,2016,148(4):420-32.

[8] Faurschou M,Borregaard N. Neutrophil granules and secretory vesicles in inflammation[J].Microbes Infect, 2003,5(14):1317-27.

[9] Dinauer MC,Lekstrom-Himes JA, Dale DC. Inherited Neutrophil Disorders: Molecular Basis andNew Therapies[J]. Hematology Am Soc Hematol Educ Program, 2000:303-18.

[10] Spitznagel JK,Shafer WM. Neutrophil killing of bacteria by oxygen-independent mechanisms: ahistorical summary[J]. Rev Infect Dis, 1985,7(3):398-403.

[11] Shafer WM, KatzifS, Bowers S, et al. Tailoring an antibacterial peptide of human lysosomalcathepsin G to enhance its broad-spectrum action against antibiotic-resistantbacterial pathogens[J]. Curr Pharm Des, 2002,8(9):695-702.

[12] Borregaard N.Neutrophils, from marrow to microbes[J]. Immunity, 2010,33(5):657-70.

[13] Hung CH, Huang HR,Huang CJ, et al. Purification and cloning of carp nephrosin, a secreted zincendopeptidase of the astacin family[J]. J Biol Chem, 1997,272(21):13772-8.

[14] Sterchi EE,Stocker W, Bond JS. Meprins, membrane-bound and secreted astacinmetalloproteinases[J]. Mol Aspects Med, 2008,29(5):309-28.

[15] Song HD, Sun XJ,Deng M, et al. Hematopoietic gene expression profile in zebrafish kidneymarrow[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004,101(46):16240-5.

[16] Tobin DM, May RC,Wheeler RT. Zebrafish: a see-through host and a fluorescent toolbox to probehost-pathogen interaction[J]. PLoS Pathog, 2012,8(1):e1002349.