SARS-CoV-2感染恒河猴模型
討論與結論
目前沒有確證 有效的陽性藥物，本單位用細胞模型從市售成藥中篩選有效藥物，發現 PHD1（藥品代號）可以在細胞水平抑制病毒復制，隨后用小鼠模型進行了藥效學評價。發現藥物治療感染小鼠后，臨床癥狀得到改善，病毒復制被顯著抑制，肺組織病理明顯改善，證明該藥物可治療感染小鼠。
生物安全性
評價驗證
本實驗建立的新型冠狀病毒動物模型，采用監測臨床癥狀、病毒學、病理學、影像學和免疫學等方法進行分析和鑒定，確定該動物模型成功建立。
（1）癥狀觀察：感染后每天監測體溫，記錄一般癥狀、體重，監測周期14天。
（2）病毒載量：采集 3,4,5,6,7,9,11,14天咽拭子、鼻拭子和肛拭子，感染后7天處1只猴，采集氣管、肺、脾、腸、肝、腎、腦、心、淋巴結進行RNA 抽提，利用 RT-PCR 技術，檢測組織中病毒載量。RT-PCR 所用的新型冠狀病毒引物如下：上游為5’-TCGTTTCGGAAGAGACAGGT-3’；下游為5’-GCGCAGTAAGGATGGCTAGT-3’。
病毒分離：肺組織在DMEM溶液中研磨制備成勻漿，離心分離上清后，接種于Vero細胞分離病毒并觀察細胞病變。
（3）影像學檢查：感染后 0,3,5,7,9,11,13,15天做X-RAY檢測。
（4）病理學觀察：感染后7天處死1只猴，采集氣管、肺、脾、腸、肝、腎、腦、心、淋巴結進行病理檢查。用新鮮的組織制備冰凍切片，將組織固定在冷凍劑上，肺臟組織（10um）切好后在100%丙酮內固定15分鐘，之后用HE染色，鏡下觀察。
（5）免疫熒光染色及免疫組化：肺臟切片用 PBS 洗三遍，用固定液充分固定，用封閉液室溫封閉1h，一抗4°C封閉過夜，PBS洗三遍，二抗37°C孵育1小時，PBS洗三遍。用DAPI染細胞核，觀察新型冠狀病毒在小鼠肺臟上的定位。新型冠狀病毒一抗為病人恢復期血清，羊源抗人二抗用，FITC標記。
（6）免疫學檢測：感染后第3，4，6，7，11，14天全血進行白細胞、淋巴細胞、單核細胞檢查和CD3+,CD4+,CD8+,巨噬細胞，單核細胞，以及血清中特異性抗體。
（7）數據統計處理方法
本實驗所產生的定量數據，應用統計處理軟件 SPSS(Version. 12.0)進行方差分析。
制備方法
1、實驗材料
1.1 攻毒毒株
毒株名稱：SARS-CoV-2（原 2019-nCoV, HB-01）
毒株來源：由中國疾控中心譚文杰教授提供，新型冠狀病毒的全基因組序列可以在GISAID (BetaCoV / Wuhan / IVDC-HB-01 /2020|EPI_ISL_402119)獲得，存放于中國微生物數據中心（登錄號 NMDC10013001，基因組登錄號MDC60013002-01）。
毒株培養：將新型冠狀病毒接種到 Vero 細胞進行分離和儲存。Vero 細胞培養在 DMEM（英濰捷基, 美國）添加 10%胎牛血清，100 IU/ml 青霉素和 100μg/ml 鏈霉素的培養基中，環境為 37°C，5%CO2。新型冠狀病毒的病毒滴度用標準的半數細胞感染率（a standard 50% tissue cultureinfection dose ，TCID50） 進行分析。
1.2 實驗動物動物名稱：恒河猴
動物級別：SPF 級
動物年齡：2-4 歲
動物體重：2.5-3.5kg
動物來源：來自中國醫學科學院醫學實驗動物研究所
IACUC 批準號：BLL20001
2、實驗操作規程
感染途徑：經氣管感染
感染劑量：1×106TCID50/只
感染體積：1 ml/只
3、實驗結果 （1）臨床表現恒河猴感染后一般狀態尚可，活動下降，1#體重未發生明顯變化，3#和 6#體重顯著下降。3只猴感染后體溫未發生明顯變化。
（2）病毒核酸檢測
恒河猴在感染后第 3，4，5，6，7，9，11，14 天采集鼻、咽、肛拭子進行病毒載量檢測。結果顯示在鼻和咽部可持續 11 天檢測到大量病毒核酸（見圖 4， 表 1），在消化道可持續檢測到病毒核酸的時間為 11 天（見 2）。其中，鼻部和咽部的病毒高峰期在第 3-6 天，消化道的病毒高峰期在第 3-7 天，消化道病毒載量低于呼吸道病毒載量，但病毒在消化道復制持續時間更長。
恒河猴感染后第 7 天，采集氣管、肺、脾、腸、肝、腎、腦、心進行病毒載量檢測。結果在鼻、扁桃體、下頜淋巴結、氣管和左肺上葉檢測到病毒核酸。
（3）病毒抗原檢測 恒河猴感染 7天后尸檢，通過免疫組化可在肺部和小腸內檢測到病毒抗原，主要分布于肺泡上皮、腸上皮，及肺腸的巨噬細胞內。
（4）病理學檢查恒河猴感染 7 天后尸檢，大體病變，右肺出現深紅色多灶性病變，斑塊大小不一，或散在或連成一片在。
主要組織病理學改變為：肺臟血管擴張充血，肺泡隔增寬，炎細胞浸潤。肺泡內巨噬細胞滲出（黑色箭頭），血管周圍炎細胞浸潤（綠色箭頭）
主要病變如下：
① 肺
左肺上葉：血管擴張充血，肺泡隔輕度增寬，肺泡內少量炎細胞滲出，少 數血管周圍炎細胞浸潤。
左肺中葉：肺泡內少量炎細胞滲出，血管周圍炎細胞浸潤，血管擴張充血，
左肺下葉：肺泡內少量炎細胞滲出，血管周圍少量炎細胞浸潤，血管擴張充血，出血。
右肺上葉： 肺泡隔輕度增寬，肺泡內少量炎細胞滲出，血管周圍少量炎細胞浸潤，血管擴張充血。
右肺中葉： 肺泡隔輕度增寬，肺泡內少量炎細胞滲出，血管周圍少量炎細胞浸潤，血管擴張充血。
右肺下葉： 肺泡隔增寬，肺泡內少量炎細胞滲出，血管周圍炎細胞浸潤，血管擴張充血。
右肺副葉： 肺泡隔增寬，局部肺泡腔縮窄，肺泡內少量炎細胞滲出，血管周圍炎細胞浸潤，血管擴張充血。
② 其他臟器
右腎間質小灶性炎細胞浸潤；鼻甲局部上皮脫落。胃粘膜炎細胞浸潤。扁桃體粘膜表面可見膿性滲出物。十二指腸、回腸粘膜炎細胞浸潤，上皮細胞脫落。空腸絨毛內可見寄生蟲卵。唾液腺小灶性炎細胞浸潤。
（5）影像學檢查感染后，隔天檢測恒河猴的肺部影像學改變，第11天右肺上葉透亮度減低內可見增粗肺紋理，呈磨玻璃密度改變，水平裂可見，呈細線狀。第13天右肺上葉透亮度進一步減低，肺紋理增粗，部分顯示不清，水平裂不均勻增厚；左肺上葉肺條理增粗，呈磨玻璃密度改變。第15天時，右肺上葉實變，邊緣模糊，內可見支氣管像，水平裂增厚；左肺上葉肺條理增粗，呈磨玻璃密度改變。
（6）免疫學檢測結果恒河猴感染后第3天白細胞、淋巴細胞絕對數顯著下降，淋巴細胞和單核細胞比例上升，這與臨床患者表現極為接近。感染后CD3+CD8+T細胞、CD3+CD4+T細胞和單核巨噬細胞絕對數量顯著下降，這種表現與臨床患者極為接近，分析與病毒感染直接相關。
恒河猴感染后第 3，4，6，7，11，14 天檢測血清中特異性 IgG,結果顯示恒河猴產生特異性 IgG 有明顯的個體差異，6#感染后第 11 天開始產生特異性 IgG.
研究背景
1 研究目的與意義
利用SARS-CoV-2感染恒河猴，觀察并檢測感染后的臨床癥狀、病原學、免疫學、病理學和影像學指標，獲得SARS-CoV-2感染引起肺炎發生、發展的動態數據，構建恒河猴模型，滿足致病機制、疫苗和藥物評價、傳播途徑等研究對動物模型的需求。
2 國內外研究進展
2019年底，在中國湖北武漢華南海鮮市場爆發的新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）疫情[1]，已經波及全中國及其他許多國家，被世界衛生組織定義為“國際關注的突發公共衛生事件”[2]。當務之急是要找到預防和治療新型冠狀病毒的有效措施，因此，研究新型冠狀病毒在體內的致病機制迫在眉睫。構建新型冠狀病毒肺炎的動物感染模型，不但為了解該疾病的致病性和病理損傷特征打下基礎，也是評價相關藥物和疫苗的有效性和安全性時，不可或缺的工具和科技支撐。
從臨床表現來看，新型冠狀病毒肺炎起病以發熱為主要表現，可合并輕度干咳、乏力、呼吸不暢、腹瀉等癥狀，流涕、咳痰等卡它癥狀少見。一半患者在一周后出現呼吸困難，嚴重者快速進展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、難以糾正的代謝性酸中毒和出凝血功能障礙。部分患者起病癥狀輕微，可無發熱等臨床癥狀，多在1周后恢復。多數患者預后良好，少數患者病情危重，甚至死亡。從影像學表現來看，早期呈現多發小斑片影及間質改變，以肺外帶明顯。進而發展為雙肺多發磨玻璃影、浸潤影，嚴重者可出現肺實變，胸腔積液少見（圖1）。
從免疫學表現來看，患者還可出現發病早期外周血白細胞總數正常或減低、淋巴細胞計數減少，部分患者出現肝酶、肌酶和肌紅蛋白增高。多數患者C反應蛋白和血沉升高，降鈣素原正常。嚴重者D-dimer二聚體升高，淋巴細胞進行性減少。從組織病理學表現來看，患者表現為間質性肺炎，肺泡腔大量的多核巨細胞和巨噬細胞浸潤，肺泡比彌漫性增厚，肺泡間隔增寬（圖2）。
因為新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）跟嚴重急性呼吸系統綜合癥冠狀病毒severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）具有高度的同源性，我們在SARS-CoV動物模型研制期間，發現恒河猴對該病毒敏感，感染病毒后，可在肺組織內復制，且宿主免疫反應和病理表現與臨床相似[4]，因此選用恒河猴用于模型構建。
參考文獻 :[1]. Zhu, N.,et al., A Novel Coronavirus from Patients withPneumonia in China, 2019.New England Journal of Medicine, 2020.
[2]. Wang, C., et al., A novel coronavirus outbreak of global healthconcern. The Lancet, 2020.
[3]. Lu, R., et al., Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novelcoronavirus: implications forvirus origins and receptor binding. The Lancet, 2020.
[4]. Qin C, et al.,Ananimal model of SARS producedby infection of Macacamulatta with SARS coronavirus.J Pathol. 2005 Jul;206(3):251-9.
模型信息
中文名稱:SARS-CoV-2感染恒河猴模型
英文名稱:NA
類型:新型冠狀病毒動物模型
分級:NA
用途:用于新冠肺炎COVID-19致病機制研究、疫苗和藥物評估。
研制單位:中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所，中國醫學科學院病原生物學研究所
保存單位:中國醫學科學院醫學實驗動物研究所
