6歲以下的兒童處于“免疫功能不全期”，自身免疫系統(tǒng)發(fā)育還未成熟，免疫系統(tǒng)較易受到攻擊。在一些疾病的急性期，兒童常發(fā)生免疫細(xì)胞紊亂，而引起繼發(fā)感染。有研究表明，到2025年，中國(guó)將進(jìn)入重度老齡化社會(huì)。隨著年齡的增長(zhǎng)，人體免疫系統(tǒng)功能將逐漸衰退。免疫功能不足對(duì)老年人的健康產(chǎn)生極為不利的影響。目前，許多老年病需要長(zhǎng)期用藥，部分藥物會(huì)產(chǎn)生免疫系統(tǒng)損傷的毒副作用，老年人在應(yīng)用這類藥物后，相較成年人，對(duì)損傷會(huì)更敏感且恢復(fù)更緩慢。

本實(shí)驗(yàn)以環(huán)磷酰胺為陽性藥物，可為日后評(píng)價(jià)對(duì)兒童、老人免疫系統(tǒng)有損傷作用的藥物提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。我們亦對(duì)比了幼年、成年、老年鼠外周血、胸腺、脾臟免疫細(xì)胞的相關(guān)參數(shù)以及應(yīng)用免疫抑制劑造模后的參數(shù)變化，為兒童、老人應(yīng)用對(duì)免疫系統(tǒng)有調(diào)節(jié)作用的藥物時(shí)提供參考。

在制備模型使用環(huán)磷酰胺，應(yīng)注意戴手套和口罩。剩余藥品及污染器械要注意安全處理。

1環(huán)磷酰胺對(duì)不同年齡小鼠白細(xì)胞及分類的影響

為研究不同年齡小鼠免疫損傷的發(fā)生和恢復(fù)的差異，我們首先比較了環(huán)磷酰胺對(duì)不同年齡小鼠白細(xì)胞數(shù)（109/L）、中性粒細(xì)胞比例、淋巴細(xì)胞比例的影響。未給藥時(shí)，幼年鼠白細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞比例、淋巴細(xì)胞比例與成年鼠相近；老年鼠白細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞比例顯著高于成年鼠，淋巴細(xì)胞比例顯著低于成年鼠，見表1（由于歷次測(cè)定成年鼠、老年鼠空白對(duì)照組數(shù)據(jù)無顯著差異（P＞0.05），故成年鼠老年鼠空白對(duì)照組數(shù)據(jù)均合并處理，下同）。

表1 不同年齡小鼠白細(xì)胞及分類

2）與成年鼠相比，*P＜0.05注： 1）N_{幼年鼠=3、N成年鼠、老年鼠=12；}

給藥后，對(duì)比WBC結(jié)果發(fā)現(xiàn)，成年鼠白細(xì)胞數(shù)在第3天降到52%（為了更好地反映不同年齡小鼠損傷及恢復(fù)的規(guī)律，設(shè)各年齡小鼠空白對(duì)照數(shù)據(jù)為100%，以給藥組測(cè)定值/空白對(duì)照組測(cè)定值×100%作圖，下同），至第7天即可恢復(fù)正常水平。幼年鼠變化趨勢(shì)與成年鼠相似。老年鼠白細(xì)胞數(shù)在第3天降到27%，下降幅度遠(yuǎn)大于成年鼠，且4周后只能恢復(fù)至42%，見圖1-A。

對(duì)比中性粒細(xì)胞比例發(fā)現(xiàn)，成年鼠中性粒細(xì)胞比例在第7天升高到130%，2周后可恢復(fù)至正常水平。幼年鼠中性粒細(xì)胞比例在第7天升高到221%，升高幅度大于成年鼠，2周后亦可恢復(fù)至正常水平。老年鼠中性粒細(xì)胞比例在第7天下降到59%，趨勢(shì)與成年鼠相反，4周后未能恢復(fù)到正常水平，見圖1-B。

對(duì)比淋巴細(xì)胞比例發(fā)現(xiàn)，成年鼠淋巴細(xì)胞比例在第7天小幅下降，下降到85%，2周后可恢復(fù)到正常水平。幼年鼠變化趨勢(shì)與成年鼠相似。老年鼠淋巴細(xì)胞比例在給藥后第3天即上升到119%，至第7天基本維持該水平，2周后可恢復(fù)到正常水平，見圖1-C。

2環(huán)磷酰胺對(duì)不同年齡小鼠器官指數(shù)的影響

在分析白細(xì)胞及分類的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步觀察了環(huán)磷酰胺對(duì)不同年齡小鼠免疫器官指數(shù)的影響。未給藥時(shí)，幼年鼠胸腺指數(shù)顯著高于成年鼠；脾臟指數(shù)與成年鼠無明顯差異。老年鼠胸腺指數(shù)顯著低于成年鼠；脾臟指數(shù)與成年鼠無明顯差異，見表2。

表2不同年齡小鼠器官指數(shù)

2）與成年鼠相比，*P＜0.05注：1）N幼年鼠=3、N成年鼠、老年鼠=12

對(duì)比胸腺指數(shù)發(fā)現(xiàn)：成年鼠胸腺指數(shù)在給藥后第3天下降至58%，至第28天，只能恢復(fù)至77%。幼年鼠損傷及恢復(fù)情況與成年鼠相似。老年鼠胸腺指數(shù)在給藥后第3天未有明顯變化，第7天下降至55%，降至最低值時(shí)間晚于成年鼠，第14天后可恢復(fù)至正常值，見圖2-A。

對(duì)比脾臟指數(shù)發(fā)現(xiàn)：成年鼠脾臟指數(shù)在第3天下降至73%，第7天略有升高，第14天后可恢復(fù)至正常值。幼年鼠在第7天下降至68%，降至最低值時(shí)間晚于成年鼠，恢復(fù)情況與成年鼠相似。老年鼠在第3天下降至40%，下降程度高于成年鼠，至第7天，基本維持損傷水平，恢復(fù)情況與成年鼠相似，見圖2-B。

圖2環(huán)磷酰胺對(duì)不同年齡小鼠器官指數(shù)的影響

A:胸腺指數(shù)；B:脾臟指數(shù)

注：N=5；與同時(shí)間成年鼠相比，*P＜0.05

3 環(huán)磷酰胺對(duì)不同年齡小鼠胸腺淋巴細(xì)胞分型的影響

在分析免疫器官指數(shù)的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步觀察了環(huán)磷酰胺對(duì)不同年齡小鼠胸腺淋巴細(xì)胞分型的影響。未給藥時(shí)，幼年鼠CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+CD8+T細(xì)胞比例均與成年鼠接近。老年鼠CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+CD8+T細(xì)胞比例均顯著低于成年鼠，見表3。

表3 不同年齡小鼠胸腺淋巴細(xì)胞分型檢測(cè)

2）與成年鼠相比，*P＜0.05注：1）N_{幼年鼠=3、N成年鼠、老年鼠=12}

給藥后，對(duì)比CD4+T細(xì)胞比例發(fā)現(xiàn)：成年鼠在給藥3天后顯著降低至36%，7天后可恢復(fù)至正常值，但是4周后再次下跌至26%。幼年鼠在給藥3天后，CD4+T細(xì)胞比例小幅下降至89%，7天后即可恢復(fù)至正常值，變化趨勢(shì)與成年鼠不同。老年鼠損傷、恢復(fù)情況與成年鼠類似，見圖3-A。

對(duì)比CD8+T細(xì)胞比例發(fā)現(xiàn)：成年鼠在給藥3天后，CD8+T細(xì)胞比例顯著下降至35%，7天后可恢復(fù)至正常值，但4周后再次下跌至13%。幼年鼠在給藥3天后，CD8+T細(xì)胞比例下降至71%，7天后即可恢復(fù)至正常值范圍，變化趨勢(shì)與成年鼠不同。老年鼠損傷、恢復(fù)情況與成年鼠類似，見圖3-B。

對(duì)比CD4+CD8+T細(xì)胞比例發(fā)現(xiàn)：成年鼠在給藥3天后，CD4+CD8+T細(xì)胞比例顯著下降至18%，7天后可恢復(fù)至正常值，但4周后再次下降至3%。幼年鼠在給藥3天后，CD4+CD8+T細(xì)胞比例下降至63%，第7天可恢復(fù)至正常值范圍，至第28天，再次下降至77%，變化趨勢(shì)與成年鼠不同。老年鼠損傷、恢復(fù)情況與成年鼠類似，見圖3-C。

圖3 環(huán)磷酰胺對(duì)不同年齡小鼠胸腺淋巴細(xì)胞分型的影響

A:胸腺CD4+細(xì)胞比例；B:胸腺CD8+T細(xì)胞比例；C:胸腺CD4+CD8+T細(xì)胞比例

注：N=5；與同時(shí)間成年鼠相比，*P＜0.05

4環(huán)磷酰胺對(duì)不同年齡小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分型的影響

調(diào)節(jié)性T（Treg）細(xì)胞在調(diào)控T細(xì)胞的發(fā)育和功能中起重要作用。在分析胸腺細(xì)胞分型的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步觀察了環(huán)磷酰胺對(duì)不同年齡小鼠脾臟細(xì)胞分型的影響。未給藥時(shí)，幼年鼠B細(xì)胞比例顯著低于成年鼠；Treg細(xì)胞顯著高于成年鼠。老年鼠B細(xì)胞、Treg細(xì)胞比例均顯著低于成年鼠，見表4。

表4 不同年齡小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分型檢測(cè)

2）與成年鼠相比，*P＜0.05注：1）N_{幼年鼠=3、N成年鼠、老年鼠=12}

給藥后，對(duì)比B細(xì)胞比例：成年鼠在給藥后，B細(xì)胞比例持續(xù)走低，第14天達(dá)最低值43%，4周后可恢復(fù)至86%。幼年鼠、老年鼠在給藥后，B細(xì)胞比例無明顯變化，均與成年鼠變化趨勢(shì)不同，見圖4-A。

對(duì)比Treg細(xì)胞比例發(fā)現(xiàn)：成年鼠在給藥3天后，Treg細(xì)胞比例下降至59%，至第7天下降至最低值4%，4周后可恢復(fù)至126%。幼年鼠損傷情況與成年鼠類似，但4周后僅能恢復(fù)至66%。老年鼠損傷、恢復(fù)情況與成年鼠類似，見圖4-B。

圖4環(huán)磷酰胺對(duì)不同年齡小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分型的影響

A:脾臟B細(xì)胞比例；B:脾臟Treg細(xì)胞比例

注：N=5；與同時(shí)間成年鼠相比，*P＜0.05

5 環(huán)磷酰胺對(duì)不同年齡小鼠外周血淋巴細(xì)胞分型的影響

在分析脾臟細(xì)胞分型的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步觀察了環(huán)磷酰胺對(duì)不同年齡小鼠外周血淋巴細(xì)胞分型的影響。未給藥時(shí)，幼年鼠NK細(xì)胞與成年鼠比例相近；B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞隨著年齡的增長(zhǎng)，至第28天與成年鼠比例相近；CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞存在反跳后回落現(xiàn)象，至第28天與成年鼠比例相近。老年鼠巨噬細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞與成年鼠比例相近；NK細(xì)胞比例高于成年鼠；CD4+T細(xì)胞比例低于成年鼠，見表5。

表5 不同年齡小鼠外周血淋巴細(xì)胞分型檢測(cè)

2）與成年鼠相比，*P＜0.05注：1）N幼年鼠=3、N成年鼠、老年鼠=12

給藥后，對(duì)比NK細(xì)胞比例發(fā)現(xiàn)：成年鼠在給藥7天后NK細(xì)胞比例下降至 29%，至第28天，經(jīng)過小幅反跳后恢復(fù)至106%。幼年鼠在給藥后第3天，NK細(xì)胞比例無明顯變化，至第7天，上升至149%，至第28天依然維持該水平，變化趨勢(shì)與成年鼠不同。老年鼠在給藥3天后，NK細(xì)胞比例下降至53%，至第28天，依然維持該水平，變化趨勢(shì)與成年鼠不同，見圖5-A。

對(duì)比B細(xì)胞絕對(duì)數(shù)發(fā)現(xiàn)：成年鼠在給藥后第3天，B細(xì)胞比例驟降至2%，至第7天，可恢復(fù)至45%，第14天反跳至122%，4周后回落到57%。幼年鼠損傷及恢復(fù)趨勢(shì)與成年鼠類似，恢復(fù)情況優(yōu)于成年鼠。老年鼠在給藥后第3天，B細(xì)胞比例驟降至1%，至第7天，可恢復(fù)至25%，至第28天，一直維持該水平，恢復(fù)趨勢(shì)與成年鼠不同，且恢復(fù)能力弱于成年鼠，見圖5-B。

對(duì)比巨噬細(xì)胞比例發(fā)現(xiàn)：成年鼠在給藥3天后，巨噬細(xì)胞比例驟降至20%，至第7天反跳至192%，至第28天可恢復(fù)至正常值。幼年鼠變化趨勢(shì)與成年鼠類似。老年鼠：在給藥后第3天，巨噬細(xì)胞比例驟降至14%，至第7天回升到144%，至第28天回落到56%，變化趨勢(shì)與成年鼠不同，見圖5-C。

對(duì)比CD4+T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)發(fā)現(xiàn)：成年鼠在給藥3天后，CD4+T細(xì)胞比例驟降至4%，至第7天即可恢復(fù)正常值范圍。幼年鼠在給藥3天后，CD4+T細(xì)胞比例下降至30%，至第7天僅能恢復(fù)至47%，第14天可恢復(fù)正常值范圍，恢復(fù)能力弱于成年鼠。老年鼠在給藥3天后，CD4+T細(xì)胞比例驟降至1%，7天后僅能恢復(fù)至58%，第14天小幅回升，至第28天跌至63%，恢復(fù)情況弱于成年鼠，見圖5-D。

對(duì)比CD8+T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)發(fā)現(xiàn)：成年鼠在給藥3天后，CD8+T細(xì)胞比例驟降至3%，至第7天，可恢復(fù)至70%，第14天時(shí)小幅回升，至第28天可恢復(fù)至正常值。幼年鼠在給藥后第3天，CD8+T細(xì)胞比例下降至20%，7天可恢復(fù)至39%，2周時(shí)可恢復(fù)至122%，恢復(fù)能力弱于成年鼠。老年鼠在給藥后第3天，CD8+T細(xì)胞比例驟降至3%，至第7天可恢復(fù)至83%，此后仍維持該水平，恢復(fù)情況弱于成年鼠，見圖5-E。

圖5 環(huán)磷酰胺對(duì)不同年齡小鼠外周血淋巴細(xì)胞分型的影響

A:外周血NK細(xì)胞比例；B:外周血B細(xì)胞比例；C:外周血巨噬細(xì)胞比例；

D:外周血CD4+T細(xì)胞比例；E:外周血CD8+T細(xì)胞比例

注：N=5；與同時(shí)間成年鼠相比，*P＜0.05

6 環(huán)磷酰胺對(duì)不同年齡小鼠血漿IgA、IgG、IgM含量的影響

在分析外周血淋巴細(xì)胞分型的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步觀察了環(huán)磷酰胺對(duì)不同年齡小鼠血漿IgA、IgG、IgM的影響。未給藥時(shí)，幼年鼠IgA、IgM含量與成年鼠相近，IgG含量顯著高于成年鼠。老年鼠IgA、IgG、IgM含量均顯著高于成年鼠，見表6。

表6 不同年齡小鼠血漿IgA、IgG、IgM含量檢測(cè)

2）與成年鼠相比，*P＜0.05注：1）N_{幼年鼠=3、N成年鼠、老年鼠=12}

給藥后，對(duì)比血漿IgA含量發(fā)現(xiàn)：成年鼠在給藥后第3天，IgA含量下降至7%，至第2周，依然維持在較低水平，至第4周可恢復(fù)至83%。幼年鼠在給藥后第3天，IgA含量下降至62%且至第4周可完全恢復(fù)。損傷恢復(fù)情況優(yōu)于成年鼠。老年鼠變化趨勢(shì)與成年鼠基本一致。

對(duì)比血漿IgG含量發(fā)現(xiàn)：成年鼠在給藥后第3天，IgG含量驟降至5%，至第7天，依然維持較低水平且4周只能恢復(fù)至原來的50%。幼年鼠在給藥后第7天，IgG含量下降至38%，至第2周即可完全恢復(fù)。老年鼠損傷情況與幼年鼠相似，但恢復(fù)緩慢，至第4周只能恢復(fù)至75%。

對(duì)比血漿IgM含量發(fā)現(xiàn)：成年鼠在給藥后第3天，IgG含量降至37%，至第4周可完全恢復(fù)。幼年鼠、老年鼠變化情況與成年鼠基本一致。

圖6 環(huán)磷酰胺對(duì)不同年齡小鼠血漿IgA、IgG、IgM含量的影響

A:血漿IgA含量；B:血漿IgG含量；C血漿IgM含量

注：N=5；與同時(shí)間成年鼠相比，*P＜0.05

1動(dòng)物分組與模型制備幼年（3周齡，10 g左右）、青年（8周齡，22 g左右）、老年（14月齡，30 g左右）雄性C57BL/6J小鼠（SPF級(jí)）各32只購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司。CTX組成年鼠、老年鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺100mg/kg，分兩次隔天給藥，50mg/kg/次。幼年鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺劑量為72mg/kg【同種動(dòng)物間劑量換算公式：Dose(b)=Dose(a)×(Wb/Wa)2/3,W為體重(Kg)】，分兩次隔天給藥，36mg/kg/次。對(duì)照組腹腔注射等劑量生理鹽水。分別于給藥后第3天，7天，2周，4周檢測(cè)各年齡小鼠造血免疫指標(biāo)。

2 主要試劑與儀器NK1.1 ，CD11b， F4/80，CD4，CD25，F(xiàn)oxp3抗體購(gòu)自eBioscience公司；Foxp3 Buffer Set，CD8a，B220抗體購(gòu)自BD公司。注射用環(huán)磷酰胺購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司（產(chǎn)品批號(hào)：14092925）。小鼠ELISA試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司（產(chǎn)品批號(hào)：70-E-EK2742(IgA) 、70-E-EK2712(IgG)、70-E-EK2762(IgM)）。137Csγ射線照射源，加拿大原子能有限公司，GAMMA-CELL40，劑量率0.80Gy/min。流式細(xì)胞儀C6（美國(guó)BD），全自動(dòng)血液分析儀MEK-7222K（日本光電），酶標(biāo)儀MK3（ThermoMultiskan）

3模型評(píng)價(jià)方法

3.1外周血血常規(guī)檢測(cè) 給藥后第3天、7天、2周、4周，小鼠眼內(nèi)眥取血，EDTA-K3 抗凝，用全自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定白細(xì)胞數(shù)（WBC）、淋巴細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞百分比、中性粒細(xì)胞百分比。

3.2 器官指數(shù)測(cè)定小鼠稱重后取小鼠胸腺、脾臟稱重，計(jì)算胸腺、脾臟指數(shù)（器官指數(shù)=器官重量（mg）/小鼠體重（g））。

3.3 外周血IgA、IgG、IgM測(cè)定取10ul抗凝血漿，稀釋10000倍備用。復(fù)孔加入50ul1×檢測(cè)緩沖液和50ul 2倍倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品。15分鐘內(nèi)，樣本孔加入90ul 1×檢測(cè)緩沖液和10ul預(yù)稀釋的樣本。室溫孵育2小時(shí)。洗滌后每孔加入100ul稀釋的檢測(cè)抗體。室溫孵育1小時(shí)。洗滌后每孔加入100ul顯色底物，避光，室溫孵育5-30分鐘。每孔加入100ul終止液。在450nm波長(zhǎng)檢測(cè)OD值。

3.4外周血淋巴細(xì)胞分型測(cè)定每管取50ul抗凝血，按照流式表面染色方法分別標(biāo)記CD4/CD8a和NK1.1/F4/80/B220/CD11b。室溫避光孵育30min，加入1ml 紅細(xì)胞裂解液，室溫裂解10min。1000r/min離心5min后棄上清，緩沖液洗滌1次后加入300ulPBS，4°C保存待檢。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞（CD11b+F4/80+）、B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞，CD8a+T細(xì)胞比例。外周血B220細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞，CD8a+T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)計(jì)算方法：細(xì)胞數(shù)（109/L）=B220細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞，CD8a+T細(xì)胞在總細(xì)胞中占比×淋巴細(xì)胞數(shù)。

3.5脾臟淋巴細(xì)胞分型測(cè)定制備脾細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為10^7 /ml，取100ul 細(xì)胞懸液加到EP管中。按照流式表面染色方法標(biāo)記CD4/B220/CD25。4°C避光孵育30min，加入1ml 紅細(xì)胞裂解液，室溫避光裂解10min。1000r/min離心5min后棄上清，緩沖液洗滌一次，離心完全棄上清。分別使用Foxp3 Fixation/permeabilizationbuffer，permeabilization buffer 處理細(xì)胞，按照流式表面染色方法標(biāo)記FOXP3，室溫避光孵育20min。1000r/min離心5min后棄上清，緩沖液洗滌1次后加入300ulPBS，4°C保存待檢。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)B細(xì)胞、Treg細(xì)胞(CD4+CD25+FOXP3+)比例。

3.6胸腺淋巴細(xì)胞分型測(cè)定 制備胸腺細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為10^7 /ml，取100ul 細(xì)胞懸液加到EP管中。按照流式表面染色方法標(biāo)記CD4/CD8。4°C避光孵育30min，1000r/min離心5min后棄上清，緩沖液洗滌1次后加入300ulPBS，4°C保存待檢。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+CD8+T細(xì)胞比例。

3.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用Prism5軟件處理數(shù)據(jù)、作圖。各指標(biāo)間兩組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（`X±s）表示。

1、造模因素信息

環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide，CTX）是進(jìn)入人體內(nèi)被肝臟或腫瘤內(nèi)存在的過量的磷酰胺酶或磷酸酶水解，變?yōu)榛罨饔眯偷牧柞０返娑鹱饔玫牡骖愌苌铩？沽鲎V廣，是第一個(gè)所謂“潛伏化”廣譜抗腫瘤藥，對(duì)白血病和實(shí)體瘤都有效。同時(shí)作為免疫抑制劑，用于各種自身免疫性疾病，如嚴(yán)重類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡、兒童腎病綜合征、多發(fā)性肉芽腫、天皰瘡以及潰瘍性結(jié)腸炎、特發(fā)性血小板減少性紫癜等。也用于器官移植時(shí)抗排斥反應(yīng)，通常與潑尼松、抗淋巴細(xì)胞球蛋白合用。

2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背景信息

健康幼年（3周齡，10 g左右）、青年（8周齡，22 g左右）、老年（14月齡，30 g左右）雄性C57BL/6J小鼠（SPF級(jí)）。

3、研究背景

接受藥物治療的患者中，有相當(dāng)一部分是特殊人群，如新生兒、嬰幼兒、兒童、妊娠期和哺乳期婦女、老年人等，因其生理、生化和病理等機(jī)制與普通人群存在較大差異，有著不同的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)特征，用藥安全形勢(shì)十分嚴(yán)峻。

免疫系統(tǒng)可以對(duì)病原體侵入人體做出適度反應(yīng)，從而保持人體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。免疫系統(tǒng)的免疫應(yīng)答可分為固有免疫和獲得性免疫。固有免疫細(xì)胞是機(jī)體非特異免疫的重要組成部分，包括中性粒細(xì)胞、NK 細(xì)胞等；獲得性免疫包括參與體液免疫的B 細(xì)胞及參與細(xì)胞免疫的T 細(xì)胞等。一般來說，人至青春期免疫系統(tǒng)才發(fā)育成熟，兒童免疫細(xì)胞表現(xiàn)出數(shù)量不足和功能不成熟。成年人的免疫系統(tǒng)日趨成熟，隨著年齡的增長(zhǎng)，人的免疫功能逐漸衰退，60 歲以上老人T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、NK 細(xì)胞等會(huì)出現(xiàn)生成數(shù)量減少或代謝活力下降等現(xiàn)象。

少年兒童免疫系統(tǒng)發(fā)育不成熟，疾病譜與成年人多有不同。所以在用藥方面在考慮有效性的同時(shí)還要考慮用藥安全尤其的遠(yuǎn)期的安全性，以保證患者痊愈后的生存質(zhì)量。如抗腫瘤藥物的研發(fā)，兒童腫瘤多來源于中胚層，在藥物選擇性上與成年人不同。對(duì)藥物的代謝差異也影響到了藥物毒副作用尤其是對(duì)健康的遠(yuǎn)期影響都需要注意。

老年人視為“特殊人群”，因?yàn)樗麄冊(cè)诠膊《唷⑼瑫r(shí)使用多種藥物，在藥代動(dòng)力學(xué)、發(fā)生藥物不良反應(yīng)（ADR）方面與年輕人不同。醫(yī)療實(shí)踐通常基于從臨床試驗(yàn)中得出的單一疾病指南，這些臨床試驗(yàn)不包括體弱的老年人或患有多種疾病的人。這些則易導(dǎo)致老年人用藥不良反應(yīng)事件增加。

綜上，在臨床前安全性研究中，采用幼年及老年動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察逐年來引起了重視，是為臨床用藥提供參考數(shù)據(jù)。

環(huán)磷酰胺作為一種免疫抑制劑，已有大量研究表明其能抑制體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，對(duì)B 細(xì)胞損傷作用尤為明顯。本研究利用幼年鼠及老年鼠制備CTX免疫模型，觀察CTX處理后不同年齡小鼠免疫細(xì)胞損傷及恢復(fù)情況，為特殊人群用藥提供模型。

參考文獻(xiàn)：

Barry E, Walsh JA, Weinrich SL, Beaupre D, Blasi E, Arenson DR, Jacobs IA. Navigating the Regulatory Landscape to Develop Pediatric Oncology Drugs: Expert Opinion Recommendations. Paediatr Drugs. 2021 Jul;23(4):381-394.

Davies EA, O'Mahony MS. Adverse drug reactions in special populations - the elderly. Br J Clin Pharmacol. 2015 Oct;80(4):796-807. doi: 10.1111/bcp.12596. Epub 2015 May 22. PMID: 25619317; PMCID: PMC4594722.

Wang J, Avant D, Green D, Seo S, Fisher J, Mulberg AE, McCune SK, Burckart GJ. A Survey of Neonatal Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Studies in Pediatric Drug Development. Clin Pharmacol Ther. 2015 Sep;98(3):328-35. doi: 10.1002/cpt.149. PMID: 25975723.